论文解读
在癌症生物学和药物发现领域，NCI-60人类肿瘤细胞系面板是一个久负盛名的宝贵资源。它由59个细胞系组成，代表了九种不同的癌症亚型，包括乳腺癌、中枢神经系统癌、结肠癌、血癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌。这个细胞系集合不仅被用于药物筛选，还积累了大量的分子特征数据，包括基因突变、DNA甲基化、转录组、蛋白质组、激酶组和代谢组等，极大地推动了我们对癌症异质性的理解。
然而，在分子靶标的世界里，半胱氨酸（Cysteine）是一个特殊的存在。作为蛋白质组中亲核性最强的氨基酸，半胱氨酸残基参与多种调控、结构和信号传导功能。例如，蛋白酶、磷酸酶和氧化还原酶等蛋白家族利用活性位点的半胱氨酸来执行其功能。更重要的是，半胱氨酸是共价抑制剂的特权靶点，这类药物通过共价结合靶蛋白，在治疗难以成药的蛋白质方面取得了巨大的临床成功。
尽管半胱氨酸在生物学和药理学上如此重要，但科学家们对其在不同癌症背景下的反应性缺乏系统性的理解。半胱氨酸的反应性高度依赖于其微环境、组织类型和细胞状态，这使得预测其反应性变得异常复杂。为了填补这一空白，来自加州大学旧金山分校的José L. Montano、Balyn W. Zaro及其团队在《Cell Chemical Biology》杂志上发表了一项重磅研究，他们生成了迄今为止最全面的半胱氨酸反应性图谱，覆盖了整个NCI-60细胞系面板。
关键技术方法
研究人员利用NCI-60细胞系面板作为研究模型。他们首先通过无标记定量（LFQ）蛋白质组学技术，对59个细胞系的蛋白质组进行了全面分析。为了评估半胱氨酸的反应性，他们采用了同位素标记的去硫生物素（isoDTB）活性蛋白质组分析（isoDTB-ABPP）方法。该方法使用碘乙酰胺-炔烃（IA-Alk）作为泛半胱氨酸探针，在细胞裂解液中分别用高浓度（100 μM）和低浓度（10 μM）的探针进行标记，然后通过点击化学与重标或轻标的isoDTB标签偶联，最后通过质谱分析，计算反应性比率（R10:1 ），从而定量评估每个半胱氨酸的反应性。
研究结果
NCI-60蛋白质组图谱的开发
研究人员首先对NCI-60细胞系进行了全面的蛋白质组分析。他们平均在每个细胞系中鉴定到6,287种蛋白质，在整个面板中总共鉴定并定量了12,021种独特的蛋白质。与之前发表的NCI-60蛋白质组数据集相比，本研究的数据集显示出96%的重叠，并额外鉴定了3,914种蛋白质，这得益于质谱仪器灵敏度的提高和搜索算法的改进。主成分分析（PCA）显示，基于组织来源的细胞系聚类较弱，表明在蛋白质组水平上，组织特异性模式不足以完全区分组织类型。
NCI-60半胱氨酸反应性图谱的开发
接下来，研究人员利用isoDTB-ABPP方法对半胱氨酸反应性进行了分析。他们总共鉴定了36,385个独特的反应性半胱氨酸，涉及8,639种不同的蛋白质。平均每个细胞系鉴定到10,400个反应性半胱氨酸。根据反应性比率（R10:1 < 2），研究人员将半胱氨酸进一步分类为高反应性（HR）半胱氨酸。平均而言，每个细胞系中约有8.65%的半胱氨酸组被归类为HR，这与之前的研究一致。
NCI-60中功能注释的半胱氨酸
研究人员发现，在整个面板中，共有10,726个半胱氨酸至少一次被归类为HR。为了验证方法的可靠性，他们检查了已知具有功能活性的半胱氨酸。例如，线粒体乙酰辅酶A乙酰转移酶（ACAT1）上的C126半胱氨酸，在之前的研究中被鉴定为HR，在本研究中，该位点在其被检测到的所有细胞系中均被归类为HR。其他已知活性位点半胱氨酸，如ALDH6A1上的C317、PDIA1上的C397等，也一致地被鉴定为HR。
跨多个细胞系的高反应性是半胱氨酸功能的指标
研究人员进一步分析了高反应性与功能注释之间的关系。他们发现，在整个反应性半胱氨酸数据集中，有7.4%的位点位于已知活性或结合位点或其附近；而在HR半胱氨酸子集中，这一比例为8.4%。虽然这种富集程度较弱，但研究人员发现，在至少39个细胞系中被一致检测为HR的半胱氨酸中，有22.3%具有功能注释或位于功能位点附近。这表明，在多个细胞系中一致检测到的HR半胱氨酸池，富含功能注释的半胱氨酸。
蛋白质表达不足以解释细胞系特异性的半胱氨酸反应性
研究人员发现，在鉴定的36,385个反应性半胱氨酸中，有近21%（7,559个）仅在一个细胞系中被定量，而只有2.9%（1,066个）在所有细胞系中被定量。这与蛋白质组数据形成鲜明对比，蛋白质组数据显示有22%的蛋白质在所有细胞类型中普遍存在。进一步分析发现，在仅在一个细胞系中被定量的半胱氨酸所对应的蛋白质中，有近一半（47.0%）在面板中超过29个细胞系中被检测到。这表明，细胞系特异性的半胱氨酸反应性独立于蛋白质表达。
半胱氨酸高反应性的异质性
研究人员比较了NCI-60中半胱氨酸反应性的异质性。他们发现，有30.5%的HR半胱氨酸仅在一个细胞系中被注释为HR，而在其他细胞系中仅为反应性，这进一步支持了细胞依赖性因素驱动半胱氨酸反应性的观点。研究人员特别关注了BMI1蛋白上的C166半胱氨酸（BMI1_C166）。BMI1是多梳抑制复合物1（PRC1）的核心组成部分，而C166位于BMI1与PHC2相互作用的关键位点。有趣的是，BMI1_C166在面板中表现出异质性的高反应性，这表明它可能是一个有吸引力的共价靶点，用于调节PRC1活性。
反应性半胱氨酸的结构和生化特征
为了解驱动半胱氨酸反应性的结构或生化特征，研究人员分析了在蛋白质组数据中所有细胞系均被检测到的蛋白质上的11,310个定量半胱氨酸。他们发现，在面板中一致检测到的半胱氨酸（前10%）与很少检测到的半胱氨酸（后10%）相比，具有显著更高的溶剂可及表面积（SASA）和更低的预测pKa值。这表明，IA-Alk作为半胱氨酸探针的使用偏向于更易溶剂化和pKa更低的半胱氨酸。
用于探索NCI-60蛋白质组和反应性半胱氨酸图谱的交互式数据库
为了确保数据的广泛可及性，研究人员开发了一个基于网络的数据库和应用程序（
https://cysteine.app/ ）。该资源允许用户浏览蛋白质组和反应性半胱氨酸图谱，根据感兴趣的蛋白质或半胱氨酸靶点生成定制的细胞系面板，并进行以半胱氨酸为中心的数据分析。例如，用户可以通过输入“激酶”，利用该工具生成一个包含OVCAR-8、OVCAR-3、HL-60、M14和CCRF-CEM这五个细胞系的最小面板，该面板可以覆盖338种独特的激酶，占激酶组的65.6%。
组织水平分析揭示了泛癌组织蛋白质组和组织特异性蛋白质组
研究人员对NCI-60中的组织类型进行了分析。他们发现，数据中12,021种独特蛋白质中有50.4%（6,063种）在所有组织类型中共享。对组织特异性蛋白质进行基因本体（GO）术语分析发现，仅在血癌细胞系中检测到的蛋白质在免疫细胞功能相关过程中显著富集。
NCI-60半胱氨酸图谱中的组织特异性高反应性半胱氨酸
在组织水平的半胱氨酸分析中，研究人员发现了9,439个在所有组织中共享的半胱氨酸，代表了泛癌半胱氨酸组。对于HR半胱氨酸子集，每个组织平均有505个半胱氨酸是组织特异性的HR。值得注意的是，携带组织特异性HR半胱氨酸的大多数蛋白质在面板的细胞系中普遍表达，这排除了组织特异性表达是差异检测的原因。研究人员发现了一个高度组织选择性的HR半胱氨酸：Copine-III（CPNE3）上的C54（CPNE3_C54）。该半胱氨酸在面板的所有细胞系中均被鉴定，但仅在九个黑色素瘤癌细胞系中的六个中表现为HR。此外，研究人员还发现，在乳腺癌和前列腺癌中，参与Wnt信号通路的半胱氨酸显著富集。特别值得注意的是，p53上的C275在前列腺癌细胞系DU145中是独特的HR，这为恢复突变p53功能提供了潜在的可操作靶点。
研究结论与讨论
本研究首次在NCI-60细胞系面板上进行了泛癌半胱氨酸反应性评估，并将其与全蛋白质组分析相结合。该数据集揭示了半胱氨酸反应性比之前认为的更具异质性，尽管蛋白质表达谱相对稳定，但半胱氨酸反应性在组织和单个细胞系之间差异很大。这些发现强调了半胱氨酸的行为（以及因此产生的半胱氨酸配体性）受到细胞背景的强烈影响。
研究人员发现，跨多个不同细胞和组织类型保守的半胱氨酸高反应性与半胱氨酸功能密切相关。这些观察结果完善了当前将内在高反应性与功能重要性联系起来的模型，并表明研究不同细胞背景下的半胱氨酸反应性有助于识别具有新生物学作用的半胱氨酸。
本研究还说明了半胱氨酸组的明显不完整性。即使将细胞系数量增加7倍，总覆盖率仍然有限，这支持了存在大量未开发的“暗”半胱氨酸组的观点。为了最大限度地提高可及性和实用性，研究人员开发了一个公共网络资源，使研究人员能够交互式地探索半胱氨酸反应性，并支持根据用户定义的靶点定制细胞系面板的组装。
总之，这些发现重新定义了人类癌细胞中半胱氨酸反应性的格局，并为机制和治疗的深入研究开辟了新的途径。该数据集的广度为将半胱氨酸中心测量与NCI-60已有的广泛基因组、转录组、代谢组和药理学注释相结合奠定了基础。这种多组学分析，辅以新兴的结构和机器学习方法，将加深我们对半胱氨酸行为决定因素的理解，并加速发现具有功能或治疗潜力的反应性位点。
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