引言
骨骼肌在应对收缩刺激时表现出显著的表型可塑性。抗阻训练（RET）通过施加机械张力增加骨骼肌的尺寸和力量生成能力。经典理论将RET后骨骼肌组织的增加称为骨骼肌肥大，定义为负荷响应下肌肉或肌纤维横截面积（CSA）的轴向增加。近期深度磷酸化蛋白质组学分析揭示，RET激活了涉及MKK3b/6、p38、MK2和mTORC1的特异性信号通路，该通路的激活与肌原纤维蛋白合成（MyoPS）密切相关，最终驱动肌原纤维生成——这是骨骼肌轴向扩张的主要介质。
人类骨骼肌对收缩负荷的肥大反应存在显著的个体间异质性。这种异质性在多大程度上由内源性（固有生物因素）或外源性变量（外部负荷）介导尚未明确。尽管个体在RET诱导的适应（包括肥厚和力量增长）方面表现出相当大的差异，但已有假说认为，固有的内源性因素（即个体的固有生物反应）是RET诱导骨骼肌肥厚个体间变异的最大来源，而非外源性RET变量的操纵。
本研究旨在确定外部负荷（外源性因素）和肢体位置（上肢与下肢；内源性因素）对RET诱导的骨骼肌尺寸和力量变化的相对影响。采用单侧、体内对照设计评估外部负荷（高负荷HL与低负荷LL）和肢体位置对10周力竭性RET后骨骼肌肥厚和力量的影响。通过利用解剖学上不同的肌肉群进行体内对照设计，能够评估同一个体内不同肌肉群之间的骨骼肌可塑性，从而增加观察RET反应保守性的可能性。我们假设个体内反应（即使用不同负荷的不同肢体之间骨骼肌肥厚的个体内变异性）将显著低于参与者之间的特征性异质反应。这种情况将表明内源性机制可能是负荷诱导肌肉肥大的更重要驱动因素。
研究方法
参与者
20名健康、业余活动但未经过训练的年轻男性参与了本研究。研究方案经汉密尔顿综合研究伦理委员会批准，并在ClinicalTrials.gov注册。每位参与者在知情同意后参与实验。
研究概述
每位参与者的手臂和腿部（基于单次最大重复次数1RM力量）被随机分配至高负荷、低重复次数RET（HL：8-12次重复，约70%-80% 1RM）或低负荷、高重复次数（LL：20-25次重复，约30%-40% 1RM）组，采用平衡设计。对侧肢体被分配至相反条件，使得训练负荷随机化且平衡，不受肢体优势影响。
参与者每周完成三次监督式RET课程（周一、周三、周五），持续10周。每次RET课程包括三组单侧膝伸展和哑铃牧师弯举，根据各肢体条件（HL或LL）分配。每组间隔休息90秒，每次重复以2:0:2秒节奏（离心：等长暂停：向心）进行，保持正确形式。每组要求参与者达到力竭，定义为无法以正确形式完成另一次全范围向心肌肉动作。训练课程依从性为100%。调整每组负荷，确保HL和LL肢体分别在8-12次和20-25次重复内达到力竭。
饮食控制
通过饮食记录，参与者提供熟悉期（第0周）、第1周和第10周共3天的饮食回忆。使用NutriBase膳食分析软件分析饮食回忆。此外，参与者在研究期间每天两次（运动后和睡前）摄入25克乳清蛋白分离物，确保每日蛋白质摄入量充足（>1.6克/公斤体重/天）。整个研究期间蛋白质、碳水化合物或脂肪消耗无变化。
肌肉力量
在第一次RET课程前和最后一次RET课程后72小时测量肌肉力量，使用最大自主收缩（MVC）和1RM。MVC包括每个肢体（膝伸展60°和肘屈曲110°）三次5秒等长尝试，每次尝试间隔休息120秒。在记录基线测量前，参与者熟悉执行MVC。进一步记录单侧膝伸展和单侧哑铃牧师弯举1RM，在一般热身（5分钟自行车测功计）后进行，负荷逐渐增加（膝伸展约4.5公斤，哑铃牧师弯举约2.5公斤），重复次数减少（约8、5、3和1次），每组间隔休息120秒，直至参与者无法完成一次成功重复。
脂肪和骨骼无脂肪（瘦）质量
使用双能X射线吸收测定法（DXA）在过夜空腹后（干预前和干预后）和最后一次运动后72小时（干预后）评估脂肪和骨骼无脂肪（瘦）质量（FBFM）。数据在中等扫描模式下分析。每个分析区域（头、躯干、手臂和腿）由软件分区，然后由盲法研究调查员手动检查。基于我们实验室的重复扫描，FBFM的变异系数（CV）小于1.6%。
肌肉厚度和横截面积
使用B型超声检查（US）评估肌肉厚度和CSA，在训练前和训练后由同一技术员执行，与我们实验室先前工作一致。在我们实验室，10周内US分析肌肉尺寸的评估者内可靠性良好至优秀，组内相关系数（ICC）为0.940。评估者间可靠性中等至优秀（ICC=0.847）。10周内所有时间点US与MRI（测量肌肉尺寸的公认“金标准”技术）显著高度相关（所有r>0.85）。
每个视频文件使用Filezigzag转换为TIFF帧，然后使用Autostitch拼接成全景图像。为了验证Autostitch，20组未拼接的tiff帧集（5基线肱二头肌BB、5训练后BB、5基线股外侧肌VL、5训练后VL）使用GIMP手动拼接成全景图像，类似于其他报告的质量控制方法。全景图像上传并使用ImageJ校准，然后评估CSA（使用多边形追踪工具）和肌肉厚度（MT；在每个图像最厚部分[肌腹]画一条直线）。所有图像由经验丰富的检查员在盲法下拼接和分析。每个肢体每次测量重复两次（单独捕获和拼接），显示高ICC（VL CSA:0.89；MT:0.73；BB CSA:0.92；MT:0.83）。我们图像拼接技术的已发表SEM和最小可检测变化分别为1.09 cm2和3.03 cm2。
肌纤维横截面积
使用定制Bergström针在局部麻醉（1%利多卡因）下通过手动抽吸从VL获取骨骼肌活检。基线单侧骨骼肌活检和第10周末双侧活检分别用于CSA分析。每个活检约30毫克清除结缔组织，包埋在最佳切割温度介质中，然后在液氮冷却的异戊烷中冷冻。样品在-80°C储存直至进一步分析。使用Microm HM550冷冻切片机准备连续横截面（约5 µm），注意避免样品经历冻融循环。抗肌萎缩蛋白（MANDYS1 [3B7]）、MHC I（BA-F8）、MHC IIA/X（BF-35）和MHC IIX（6H1；均来自Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA）抗体与次级同种型特异性抗体（Alexa Fluor 350 [#A21120]、488 [#A21131]、594 [#A21125]和647 [#A21238]；Invitrogen, Thermo Fisher Scientific）组合，然后使用Prolong Diamond Antifade Reagent（Life Technologies, Toronto, ON, Canada）封片，类似于我们小组先前的出版物。玻片在暗抽屉中保存，次日使用Nikon Eclipse 90i荧光显微镜在波长350 nm（IIA型肌纤维）、488 nm（肌萎缩蛋白）、594 nm（IIX型肌纤维）和647 nm（I型肌纤维）下以200倍放大成像。每个肌萎缩蛋白边界使用NIS-Elements软件圈出，并导出为单独感兴趣区域（ROI），以确定纤维类型和CSA。我们CSA分析的纳入截止值为圆度>0.80，这使得每个活检有117±63根纤维。此外，我们根据相对染色强度（即每种MHC同种型的相对表达）量化每根纤维的类型，这提供了确定混合纤维类型的客观方法。鉴于健康年轻男性中IIx和IIa/x型纤维的固有低患病率——以及它们随着抗阻训练的进一步减少——一些活检包含少量或没有这些亚型的纤维。因此，我们报告IIx和IIa/x CSA值是为了完整性和透明度，与肌肉组织学的标准实践一致，但我们认识到其低纤维计数限制了可解释性。重要的是，亚型特异性CSA值未用于任何推断分析或结果排名；只有汇总的II型CSA贡献于肥厚复合指标。因此，尽管这些数据提供了关于纤维类型转换的生物学相关背景，所有主要结论依赖于跨参与者有足够代表性的纤维组。所有图像分析由单盲研究调查员执行。
结果排名
鉴于用于在“宏观”和“微观”水平量化肥厚的方法性质不同，且类似于先前工作，我们定义聚合结果排名如下。为了评估每个参与者（和每个肢体）的相对反应，我们根据代表“肌肉”变化的结果变化幅度对个体进行排名，这些结果常用于RET研究（附肢FBFM [通过DXA；手臂和腿；HL和LL]、肌肉CSA [通过US；手臂和腿；HL和LL]、肌肉厚度 [通过US；手臂和腿；HL和LL]、I型纤维CSA [通过活检；仅腿；HL和LL]和II型纤维CSA [通过活检；仅腿；HL和LL]）。尽管我们报告了I型和汇总II型肌纤维及亚型分布的数据，但仅I型CSA和汇总II型CSA用于结果排名计算。对于每个结果，我们将排名1分配给变化最大（最正面）的个体，最小变化分配排名20。为了广泛比较每个人的上肢与下肢反应，我们分别对每个条件（HL和LL）中每个结果在上下肢的排名求和。类似地，为了广泛比较个体的肥厚反应与力量，我们分别对每个肢体肥厚和力量的每个结果排名求和。我们还比较了肢体、负荷、肥厚和力量之间的个体结果。
D2O标记和蛋白质合成测量
使用氘水（2H2O）标记新合成的肌原纤维蛋白。在第0周第一次活检后，参与者消耗八份70% 2H2O（1毫升/公斤FBFM；Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA），每90分钟一次，直至消耗8个推注（加载阶段）。在第0周和第9周加载阶段后，参与者每天早晨消耗一次每日维持剂量（1毫升/公斤FBFM）。使用salivettes（Sarstedt AG & Co, Germany）在每次加载阶段前及之后每天收集唾液样本。具体而言，参与者被指示每天早晨刷牙和服用每日维持剂量前收集唾液样本。饱和salivettes以1000 g离心5分钟以收集每个salivette底部的唾液。每个唾液样本用蒸馏水1:35稀释在自动进样器小瓶中。使用腔衰荡光谱（Picarro L2130-i分析仪, Picarro, Santa Clara, CA）检测唾液样本中的2H（D）富集。每个样本进行六次注射，最后三次δ2H测量的平均值用于数据分析（CV≤0.5%）。然后将测量值转换为原子百分过量（APE），如先前描述的蛋白质合成计算。
整合肌原纤维蛋白合成
约50毫克肌肉在缓冲液（10 µl/毫克 25 mM Tris, 0.5% v/v Triton X-100，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂片[Complete Protease inhibitor Mini-Tabs; Roche, and PhosStop; Roche Applied Science]）中匀浆，然后在4°C以1500 g离心10分钟。沉淀如先前描述溶解和离心。肌原纤维蛋白在1毫升1 M高氯酸中沉淀，并用70%乙醇洗涤两次。剩余肌原纤维沉淀在0.5 M HCl中于110°C水解72小时，然后通过Dowex H+树脂（50WX8-200树脂, Sigma-Aldrich）中的离子交换色谱纯化蛋白质结合氨基酸。如先前描述测定肌原纤维2H-丙氨酸富集。整合肌原纤维蛋白合成率（%/天）根据Wilkinson等人通过氘水将氘标记的丙氨酸掺入蛋白质计算：
ΔAPEAla是时间点之间氘标记的蛋白质结合丙氨酸的变化，APEp是时间（t）内前体（唾液富集）的平均值，乘以3.7调整可掺入丙氨酸的平均2H原子数，乘以100将值转换为百分比。对于MyoPS，由于组织可用性有限，数据仅呈现11名参与者。
统计分析
使用单因素ANOVA，以时间为自变量，评估饮食结果、FBFM、附肢FBFM和运动负荷量的变化和差异。使用时间和处理作为体内变量的双因素重复测量ANOVA分析1RM、峰值扭矩、整肌CSA、MT、肌纤维CSA和MyoPS率的变化。在存在显著主效应和/或交互效应时，使用Tukey's HSD事后检验评估均值之间的差异。对于在双肢评估的结果（负荷量、FBFM、US CSA、US MT、1RM、峰值扭矩和MyoPS率），使用配对t检验评估肢间差异。所有ANOVA、t检验和相关分析使用SPSS进行。对每个结果的CV进行Student's t检验，用于确定手臂与腿之间或平均CV是否存在显著差异。为了计算每个肥厚评估方法的个体内%CV，我们首先将每个受试者两个测量时间点的SD除以均值。然后将这些值转换为百分比并平均以获得个体内%CV。个体间%CV通过计算每个参与者这些均值的SD，除以“均值之均值”并表示为百分比获得。
线性回归用于检测每个参与者上下肢测量值之间以及每个参与者肌肉尺寸和力量变化之间的共享方差。Pearson相关和CV用于评估跨结果和参与者内的变异性。所有回归使用GraphPad Prism进行。统计学显著性设定为P<0.05。当数据以箱线图呈现时，箱为四分位距；十字为均值；线为中位数；须为最小和最大值；阴影区域为累积测量误差。当数据以瀑布图呈现时，每个参与者的相对变化由跨结果的相同符号指示，阴影区域代表累积测量误差。表格数据在文本中以均值±SD呈现，除非另有说明。
研究结果
肌肉肥大和力量
对于腿部，10周训练期间LL（81,968±26,924公斤）和HL（78,583±22,984公斤）条件之间的平均负荷量无显著差异（P=0.197）。然而，对于手臂，10周训练期间HR（58,756±12,351公斤）和LR（38,334±8,496公斤）条件之间的平均负荷量存在显著差异（P<0.001）。10周RET导致DXA衍生的FBFM、整肌CSA、整肌MT和肌纤维CSA增加。当数据按肢体位置合并时，无论负荷如何，腿FBFM（∆0.30±0.30公斤, P<0.0001）、臂FBFM（∆0.17±0.14公斤, P<0.0001）、BB CSA（∆1.30±0.94 cm2, P<0.0001）、VL MT（∆0.14±0.25 cm, P=0.001）、BB MT（∆0.10±0.34 cm, P<0.0001）、I型纤维CSA（∆549±1,381 µm2, P=0.016）和II型纤维CSA（∆762±1,729 µm2, P=0.008）增加，但VL CSA（∆0.72±2.53 cm2, P=0.078）无显著增加。任何评估肌肉尺寸的结果测量在HL和LL之间无显著差异（所有P>0.05）。IIx和IIa/x型纤维的肌纤维百分比分布在HL（%IIx型: ∆−20.59±37.34, P=0.003; %IIa/x型: ∆40.46±106.40, P=0.010）和LL（%IIx型: ∆−23.62±40.82, P=0.001; %IIa/x型: ∆97.06±127.88, P=0.014）组中分别显著变化。相比之下，I型和IIa型肌纤维的分布从基线起在HL（%I型: ∆−0.00±0.37, P=0.969; %IIa型: ∆0.37±2.61, P=0.570）或LL（%I型: ∆0.15±0.50, P=0.202; %IIa型: ∆1.21±4.84, P=0.288）组中无变化。
用于确定肥厚的测量技术之间关系有限（每个测量的增量变化），手臂的所有r<0.192, P>0.05，如Pearson积矩相关所示。对于腿部，US CSA与I型（r=−0.321, P=0.044）和II型纤维CSA（r=−0.414, P=0.008）负相关，US MT也是如此（r=−0.343, P=0.032; r=−0.480, P=0.002）。腿部的两种US测量显著相关（r=0.556, P<0.0001），I型和II型纤维CSA也是如此（r=0.790, P<0.0001）；然而，测量之间未观察到其他统计学显著关联。
肱二头肌弯举1RM（HL: 3.8±4.3, P=0.011; LL: 3.2±4.8公斤, P=0.004）、膝伸展1RM（HL: 24±11, P<0.0001; LL: 22±9公斤, P<0.0001）、等长肘屈曲峰值扭矩（HL: 11±10, P=0.003; LL: 12±15 Nm, P<0.001）和等长膝伸展峰值扭矩（HL: 38±53, P=0.008; LL: 42±41 Nm, P=0.006）增加，HL和LL之间无差异（所有P>0.05）。与肥厚测量相反，手臂力量测量（r=0.728, P<0.0001）和腿部力量测量（r=0.705, P<0.0001）之间存在强且统计学显著的关系。
尽管肥厚反应存在相当大的异质性，但RET诱导的肥厚在个体内（即上下肢之间）存在显著共享方差（R2=0.492, P<0.001），并且在HL和LL条件之间（R2=0.382, P=0.004）也存在显著共享方差。相对（百分比）变化为[均值（范围）]：臂FBFM 4.8%（−2.7%至13%）、腿FBFM 3.1%（−2.0%至7.5%）、臂CSA 13.8%（1.1%–27.0%）、腿CSA 4.7%（−10.2%至18.9%）、臂MT 7.6%（−4.0%至18.7%）、腿MT 6.3%（−4.2至23.6%）、I型纤维CSA 12.0%（−23.7%至48.7%）和II型纤维CSA 17.9%（−29.6%至95.6%）。值得注意的是，基线力量与肥厚反应程度之间无关联。每个结果的个体间CV显著大于个体内CV。
10周RET后肌肉力量的百分比变化范围：肘屈曲峰值扭矩−19%至48%、膝伸展峰值扭矩−23%至70%、哑铃肱二头肌弯举1RM −14%至100%、膝伸展1RM 10%至177%。跨肢体和条件的个体内CV平均为18.1±9.9%，个体间CV平均为31.3±13.8%（P=0.176）。
有趣的是，肥厚和力量的排名得分之间无关系；然而，上下肢力量变化之间存在显著共享方差（相关）（R2=0.351, P=0.006），并且HL和LL条件之间的力量排名也存在显著共享方差（R2=0.656, P<0.0001）。
整合肌原纤维蛋白合成率
合并的MyoPS率在RET早期和晚期相对于休息时增加（第1周: Δ0.27±0.11, P<0.0001; 第10周: Δ0.10±0.14 %/天, P=0.009）；然而，最后一周增加减弱（第10周与第1周: Δ−0.16±0.18 %/天, P<0.001）。按条件，早期阶段HL（P<0.0001）和LL（P<0.001）的MyoPS率相对于休息时升高，但晚期阶段率与休息无显著差异（P=0.108, P>
