合成生物学工具包开发：实现质粒依赖性嗜热甲基营养菌Bacillus methanolicus的基因组编辑与L-精氨酸甲醇生物合成

本研究针对嗜热甲基营养菌Bacillus methanolicus遗传操作工具匮乏的瓶颈，开发了包含高效电转、CRISPR-ThermoCas9多基因编辑、中性位点整合及云端代谢模型iBM822的合成生物学工具包。通过系统解析质粒依赖性甲基营养机制，研究人员成功将大质粒pBM19染色体整合，构建了不退化甲基营养菌株，并借助代谢模型指导解除L-arginine反馈抑制，首次实现甲醇至L-精氨酸的高效转化。该工具包为甲基营养机制解析和C1生物制造提供了关键技术支撑。

在全球碳中和战略背景下，利用一碳化合物（C1）如甲醇、二氧化碳等作为底物进行生物制造，被视为实现可持续发展的重要路径。甲基营养菌（methylotroph）能够以C1化合物为唯一碳源和能源生长，因而成为C1生物制造的理想底盘细胞。其中，Bacillus methanolicus（甲醇芽孢杆菌）作为一种独特的嗜热（thermophilic）且质粒依赖性（plasmid-dependent）的甲基营养菌，其最适生长温度高达50–55°C，并能在海水培养基中快速生长，展现出显著的应用优势：高温发酵可降低冷却能耗、减少杂菌污染、提高反应效率并节约淡水资源。然而，与大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等传统模式微生物相比，B. methanolicus的合成生物学工具长期以来极为有限，严重制约了其基础生物学研究及产业化开发。

具体而言，该菌株的甲基代谢关键基因同时存在于一个大质粒pBM19和1–2个染色体拷贝上。在无甲醇培养基中反复传代会导致pBM19丢失，进而丧失甲基营养能力，这给工业发酵中的菌株稳定性带来严峻挑战。此外，其固有的限制-修饰系统（restriction-modification system）也影响了外源DNA的转化效率。尽管已有研究尝试利用同源重组或CRISPRi（CRISPR interference）进行遗传操作，但效率低、步骤繁琐，尤其是缺乏能够实现高效、多位点基因组编辑的CRISPR-Cas9工具。同时，一个高质量、用户友好的基因组尺度代谢模型（Genome-scale metabolic model, GEM）对于指导该菌的代谢工程也至关重要。

为了解决上述问题，中国科学院天津工业生物技术研究所王钰研究员团队在《Cell Reports》上发表了题为“A synthetic biology toolkit for the plasmid-dependent and thermophilic methylotroph Bacillus methanolicus”的研究论文，开发了一套模块化、高效的合成生物学工具包，为B. methanolicus的基础研究和应用开发奠定了坚实基础。

研究人员首先对B. methanolicus的电转化（electroporation）流程进行了系统性优化，通过调整聚乙二醇（PEG）使用步骤、复苏时间以及感受态细胞收获密度等参数，将pNW33N质粒的转化效率提升了约1000倍，达到6.9 × 10³CFU/μg DNA，为后续遗传操作提供了关键前提。针对该菌嗜热的特性，研究团队选择了热稳定的ThermoCas9系统（而非常温下易失活的SpCas9）进行开发。通过测试多种启动子，最终确定了使用甘露醇诱导型启动子P_mtlRN表达ThermoCas9，以及组成型强启动子P_pta表达向导RNA（gRNA）的策略。该CRISPR-ThermoCas9系统在B. methanolicus中展现出高效的DNA双链断裂（DSBs）能力，靶向染色体基因可导致98%的致死率。利用该系统，研究人员成功实现了高达~40 kb大片段DNA的删除，并能同时编辑多个基因（如mdh2和mdh3），编辑效率在经过一轮富集后可达100%。编辑完成后，通过提高培养温度（58°C）并添加诱导剂，可在4代内实现编辑质粒的高效清除（97%）。

利用这套强大的编辑工具，研究人员首先对B. methanolicus MGA3菌株携带的两个内源质粒pBM19和pBM69的功能进行了探究。通过CRISPR-Cas9介导的质粒消除（curing），他们发现pBM19的缺失会完全废除菌株在甲醇培养基中的生长能力，而pBM69的缺失对生长无明显影响。进一步实验证实，pBM69编码的限制性内切酶BmeTI和甲基化酶构成了一个限制-修饰系统，能够有效防御缺乏m6A甲基化的外源DNA，删除BmeTI识别位点可显著提高未甲基化质粒的转化效率。

接下来，研究团队系统性地敲除了10个染色体上的甲基代谢相关基因（如mdh2, mdh3, hps, phi, pfk等），以探究其功能。结果表明，尽管pBM19上的基因拷贝是甲基营养所必需的，但染色体上的某些基因拷贝也发挥着重要作用。例如，rpe、pfk、hps和phi基因的缺失会显著影响菌株在甲醇中的生长。尤为重要的是，染色体编码的磷酸果糖激酶（Pfk）对于甲醇和甘露醇代谢都是不可或缺的。而甲醇脱氢酶基因（mdh2, mdh3）的单独或共同缺失仅引起轻微的生长缺陷，其编码的酶（Mdh2, Mdh3）在回补实验中显示出与质粒编码的MdhP相似的功能。此外，尽管体外实验表明激活蛋白Act能显著增强Mdh的活性，但act基因的缺失在体内并未影响甲醇生长，提示Act在体内并非必需。

为解决工业发酵中因质粒丢失导致的菌株退化问题，研究人员设计了一个两步CRISPR-Cas9编辑策略，成功将19 kb的pBM19大质粒整合到了染色体上的一个预先验证的中性位点NS9。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选丢失了报告基因sfGFP的细胞，获得了质粒游离的甲基营养菌株C19-1。该菌株初代在甲醇中生长较慢，但经过34代的适应性实验室进化（ALE）后，其生长速率恢复至与野生型相当。基因组重测序发现，进化菌株中mdh基因上游的突变导致其启动子活性提升了约17倍，这可能是生长恢复的原因之一。稳定性测试表明，野生型菌株在无甲醇培养基中传代10代后，约96%的菌落丢失了pBM19，而C19-1菌株在传代34代后仍能稳定保持pBM19基因和甲基营养能力。

为了辅助代谢工程设计，研究团队构建了高质量GEM iBM822，包含822个基因、1028个代谢反应和838个代谢物。该模型通过了MEMOTE测试，并整合至CAVE和QHEPath两个云端平台，方便用户进行可视化分析和途径设计。利用该模型，他们成功预测了B. methanolicus利用甲醇生长和合成L-赖氨酸、癸二酸等产物的能力。

最后，作为工具包的应用示范，研究人员利用CRISPR-Cas9编辑和代谢模型指导，首次在B. methanolicus中实现了以甲醇为底物生产L-精氨酸。他们发现，与大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中L-精氨酸生物合成存在酶活反馈抑制和转录抑制的双重调控不同，B. methanolicus中的关键限速酶乙酰谷氨酸激酶（ArgB）由于缺乏N端α-螺旋，对其终产物L-精氨酸不敏感，即不存在酶活水平的反馈抑制。然而，其生物合成受到转录抑制因子ArgR的调控。敲除argR基因后，摇瓶发酵可产生约0.2 g/L的L-精氨酸。在此基础上过表达argB基因，可将产量进一步提升4倍，达到约0.8 g/L，这表明ArgB是L-精氨酸合成的关键限速步骤。

本研究开发了一套全面、高效的合成生物学工具包，极大地提升了B. methanolicus的遗传可操作性。该工具包不仅助力于深入解析质粒依赖性甲基营养的独特生物学问题，如染色体基因功能、限制-修饰系统作用等，更重要的是，成功构建了具有稳定甲基营养特性、无退化风险的工程菌株C19-1，并示范了其在大宗氨基酸L-精氨酸的甲醇生物合成中的应用。这项工作为将B. methanolicus发展成为强大的C1生物制造底盘细胞铺平了道路，对推动低碳生物经济发展具有重要意义。未来，该工具包可进一步拓展，例如引入热稳定CRISPR-Cas12a系统以增强多重编辑能力，或通过过表达重组酶提高同源重组效率。尽管当前L-精氨酸产量尚属概念验证阶段，但已充分展示了合成生物学驱动代谢工程在非模式微生物中的巨大潜力。