作者名单：Lingyi Zhu、Isha Kinjawadekar、Caleb Prempeh、Inna A. Nikonorova、Emily T. Mirek、Esther M. Lopez、William O. Jonsson、Jordan L. Levy、Lin Wang、Xiaoxuan Li、Yeva Shamailova、Timothy J. Stanek、Elizabeth M. Snyder、Piyawan Bunpo、Robert A. Harris、Shawn M. Davidson、Ronald C. Wek、Tracy G. Anthony
美国新泽西州新不伦瑞克市罗格斯大学营养科学系，邮编08901
摘要 支链α-氨基酸（BCAA）支持蛋白质合成，其氧化过程受到支链α-酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）的调控。我们之前观察到，在Bckdk 基因敲除（KO）小鼠的大脑中，BCAA水平下降而谷氨酸水平保持不变，其他氨基酸水平上升。我们探讨了这种变化的原因，以及它在营养压力下对骨骼肌和大脑的影响。我们比较了野生型（WT）和Bckdk KO雄性小鼠的肌肉行为、蛋白质合成和营养信号传导。此外，还利用稳定同位素追踪和质谱成像技术评估了BCAA向大脑输送氮的能力。Bckdk KO小鼠在蛋白质限制条件下表现出正常的握力，但在平衡木测试中表现较差，轮跑活动也减少。在骨骼肌中，无论是喂食亮氨酸还是蛋白质都能刺激雷帕霉素复合体1（mTORC1）信号通路的激活，而禁食则会抑制该通路。禁食导致两种基因型的肌肉蛋白质合成减少，但并未激活整合应激反应（ISR）。相比之下，Bckdk KO小鼠在禁食期间表现出ISR的激活，以及Atf4 及其靶基因（包括Slc7a5 ）的表达上调。追踪研究表明，尽管总谷氨酸水平未变化，Bckdk KO小鼠的血清15 N>-BCAA浓度降低，BCAA衍生的氮进入大脑谷氨酸的量也减少。因此，在非生长期的成年小鼠中，持续的BCKDH激活限制了BCAA衍生的氮向大脑的输送，并改变了氨基酸转运蛋白的表达，这是营养匮乏时的一种适应性反应。这些数据解释了Bckdk KO小鼠运动表现不佳的原因。
引言 支链α-氨基酸（BCAA）包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸，占膳食必需氨基酸摄入量的大约35%[1]。BCAA在蛋白质中的比例远高于其在所有编码氨基酸中的比例，这突显了它们对蛋白质合成的重要性[2]。BCAA还调节对营养敏感的信号通路，如雷帕霉素复合体1（mTORC1）和整合应激反应（ISR），这些通路根据营养状况协调合成代谢和分解代谢过程[3][4][5][6][7]。 除了作为蛋白质的构建块外，BCAA还参与神经递质的合成，并通过转氨作用转化为支链酮酸（BCKA）。随后，BCAA被支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）复合体不可逆地氧化，生成酰基辅酶A衍生物，这些衍生物进入三羧酸循环并支持能量产生[8]。该途径的流量由支链α-酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）调节，该酶通过磷酸化抑制BCKDH，从而限制BCAA的氧化以维持系统平衡[1,7,9]。药物或基因手段降低BCKDK活性会增加BCAA的清除率，而不会使下游步骤饱和[10]。全身追踪研究表明，骨骼肌、棕色脂肪组织、肝脏、肾脏和心脏是循环BCAA的主要氧化场所，而大脑对全身BCAA氧化的贡献相对较小[11]。这些观察结果表明，外周氧化的变化可能会间接限制BCAA向大脑的输送。
在中枢神经系统中，BCAA尤其是亮氨酸约占大脑中谷氨酸（最丰富的兴奋性神经递质）合成的三分之一[12][13][14][15]。大脑获取BCAA依赖于转运蛋白介导的跨血脑屏障的转运，特别是Slc7a5/LAT1 ，这直接关联了全身BCAA的可用性与大脑代谢[16,17]。在人类中，BCKDK缺乏会导致循环BCAA水平显著降低，而其他氨基酸水平相对保持不变或升高，这与小头畸形、发育迟缓、癫痫和自闭症谱系障碍有关[18]。动物模型也再现了这些系统性和神经学特征。Bckdk 基因敲除大鼠表现出生长受损、肢体缩短、肌肉无力以及神经肌肉接头异常，而Bckdk KO小鼠比野生型（WT）小鼠体型更小，从断奶后开始生长延迟，并出现癫痫和后肢痉挛等神经症状[19,20]。
我们之前发现，在Bckdk KO小鼠中，大脑中的BCAA水平下降，而大多数其他氨基酸水平上升，只有谷氨酸水平保持稳定[5]。本文探讨了这种氨基酸变化的原因，以及它与大脑和骨骼肌运动行为及营养应激反应的关系。为此，我们研究了全身Bckdk KO小鼠，首先评估了它们在营养压力下的运动功能，然后比较了骨骼肌和大脑的细胞变化。在分析中，我们结合了能量消耗、肌肉力量和协调性测试以及翻译和应激信号的分子指标。我们还使用氮标记的BCAA追踪剂来量化循环中的氮流量（Fcirc ），并估算了大脑中15 N>谷氨酸的标记情况。结果表明，Bckdk 的缺失导致BCAA循环中的氮流量减少，以及BCAA衍生的氮向大脑各区域的输送减少。我们还注意到，在非生长期的成年Bckdk KO小鼠的大脑中，蛋白质合成减少，同时禁食期间激活了ISR。相比之下，骨骼肌在禁食和再喂养期间的营养感知和信号反应与WT小鼠相似，这证实了骨骼肌在BCAA利用中的优先地位。总之，非生长期成年Bckdk 小鼠的运动缺陷并非由于骨骼肌中的蛋白质稳态失调，而是由于大脑中氨基酸转运蛋白表达的改变，这可能有助于在营养匮乏时维持谷氨酸的生成。
研究设计 所有动物实验均获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循ARRIVE指南[21]进行。所有小鼠都适应了12:12小时的明暗周期。环境温度为23°C，湿度保持在40–60%之间。Bckdk KO小鼠携带一个突变Bckdk 等位基因，该基因会系统性地干扰基因表达[20]。Bckdk KO小鼠至少经过10代回交到C57BL/6J背景中
Bckdk KO小鼠表现出运动缺陷和活动能力改变鉴于Bckdk 缺乏会导致大鼠出现神经肌肉异常和神经肌肉接头紊乱[19]，我们首先评估了Bckdk KO小鼠的运动功能和活动能力。通过测量小鼠悬挂在金属网格上的时间来评估握力。Bckdk KO小鼠在多次试验中的表现与WT小鼠相似，表明其肌肉力量未受影响（图1A）。接下来通过平衡木测试评估了运动协调性
讨论 我们的研究结果表明，Bckdk KO小鼠在BCAA耗尽时表现出组织特异性的反应：骨骼肌对BCAA供应减少具有适应性恢复能力，而大脑则表现出脆弱性。在营养匮乏期间，成年Bckdk KO小鼠的ISR被激活，而再喂养可以缓解这一现象
局限性与未来方向 本研究使用稳定同位素追踪技术评估了BCAA衍生的氮向大脑的输送情况，但未直接测量血浆中的15 N-谷氨酸、循环中的支链α-酮酸或特定替代氮途径的流量。尽管BCAA衍生的氮摄入减少，但大脑中的总谷氨酸水平保持不变，这表明有来自非BCAA来源的补偿性输入，但各途径的相对贡献尚未量化，需要进一步研究。
结论 总体而言，Bckdk 的缺失增加了外周氧化，减少了BCAA对大脑谷氨酸氮的贡献。成年期大脑的神经敏感性增加，而骨骼肌则表现出较好的适应性。大脑中ISR的激活伴随着氨基酸转运蛋白（如Slc7a5 ）的表达上调，这是对BCAA限制的一种适应性反应。
作者贡献（CRediT）
概念构思（LZ、TGA）；数据管理（TJS、EML、ETM、LW）；数据分析（LZ、IK、CP、IAN、LW、XL、EMS、TGA）；资金获取（TGA、RCW）；实验设计（LZ、IK、IAN、ETM、EMS、WOJ、JLL、LW、XL、YS、PB、TGA）；方法学（RAH、SMD、XL、TGA）；项目管理（TGA）；资源协调（RAH、SMD）；软件使用（TJS）；监督（SMD、RCW、TGA）；验证（LZ、TGA）；可视化（LZ）；初稿撰写（LZ）；审稿与编辑（LZ、IK、CP、IAN、ETM、EML、WOJ）
资助
本研究得到了美国农业部NIFA项目（NC1184，TGA）和美国国立卫生研究院项目（DK109714，TGA、RCW）的支持
数据获取
与本论文相关的数据可在补充信息中找到。本研究产生的RNA测序数据可在Gene Expression Ominbus数据库中找到，访问号为GSE309126。
CRediT作者贡献声明
Lingyi Zhu： 撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、数据验证、数据分析、概念构思。Isha Kinjawadekar： 撰写 – 审稿与编辑、数据分析、数据分析。Caleb Prempeh： 撰写 – 审稿与编辑、数据分析、数据分析。Inna A. Nikonorova： 撰写 – 审稿与编辑、数据分析、数据分析。Emily T. Mirek： 撰写 – 审稿与编辑、数据分析。Esther M. Lopez： 撰写 – 审稿与编辑
利益冲突
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Anthony、Wek和Rabinowitz实验室提供的技术和科学建议与指导。
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