补体系统由严格调控的酶促级联反应组成，对先天免疫防御和组织稳态至关重要。虽然在生理条件下具有保护作用，但补体失调可驱动炎症和组织损伤，并参与自身免疫性和炎性疾病的发病机制，这促使了靶向补体疗法的开发。在此，研究人员描述了AZD6912（一种GalNAc偶联的小干扰RNA）的开发及非临床评估，该药物旨在沉默肝脏补体因子B（CFB），作为类风湿关节炎的潜在治疗手段。AZD6912在肝细胞系和原代人肝细胞球状体模型中产生了强效的靶点特异性CFB敲低，且无脱靶效应证据。在小鼠中，一种靶向肝脏Cfb的替代性小干扰RNA实现了超过90%的肝脏Cfb信使RNA减少和超过95%的循环CFB蛋白减少。这种靶点特异性沉默减少了局部补体产生，减弱了关节炎症，并在胶原抗体诱导性关节炎（CAIA）模型中提供了治疗获益。在非人灵长类动物中，AZD6912显示出高肝脏暴露量、超过80%的肝脏CFB信使RNA抑制、血清CFB的持续降低以及超过95%的补体活性抑制。安全性评估未见异常。总体而言，这些发现证明了小干扰RNA介导的CFB沉默具有持久性，并伴有下游药理学和治疗学效应，支持了AZD6912的临床开发，并突显了GalNAc-小干扰RNA疗法在免疫介导疾病中的潜力。
研究背景与目的
类风湿关节炎（RA）是一种慢性、多系统自身免疫性炎性疾病，以外周关节滑膜炎症为特征，影响全球0.2%-1%的人口，并与进行性残疾和巨大的社会经济负担相关。尽管治疗取得了进展，但许多RA患者未能达到缓解或持续的疾病低活动度，这凸显了对靶向关键致病通路（如补体激活）的新方法的需求。补体系统由超过50种蛋白质组成，对先天免疫和组织稳态至关重要。其激活通过经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和替代途径（AP）三种蛋白酶解级联反应介导。所有途径均汇聚于C3转化酶的形成，而AP C3转化酶的组装涉及补体因子B（CFB），这是一种急性期丝氨酸蛋白酶，为AP的C3/C5转化酶提供催化活性，并放大来自经典和凝集素途径的补体激活。补体成分的失调或过度激活可驱动炎症和组织损伤，在RA患者的关节中发现了免疫复合物和补体成分。研究表明，替代途径在关节病理中发挥重要作用。因此，研究人员开发了AZD6912，一种GalNAc偶联的小干扰RNA（siRNA），旨在选择性抑制肝脏CFB的表达，并进行了临床前概念验证研究，以评估其作为RA潜在治疗方法的可行性。
主要关键技术方法
- 1.
体外实验：在人肝细胞衍生的HuH7细胞系中进行siRNA序列筛选和剂量依赖性CFB敲低评估；利用来自三个不同供体的原代人肝细胞（PHH）球状体模型，结合定量逆转录PCR（RT-qPCR）和RNA测序（RNA-seq）进行转录组范围的脱靶效应分析。
- 2.
动物模型：在CD-1小鼠中进行单次和多次给药的药代动力学（PK）/药效学（PD）研究；在NZB/W F1小鼠中进行慢性给药耐受性及免疫复合物积累评估；在BALB/c小鼠中建立胶原抗体诱导性关节炎（CAIA）模型，进行预防性和治疗性给药研究。
- 3.
非人灵长类动物（NHP）研究：在食蟹猴中进行单次和多次给药的PK/PD研究，包括肝脏活检、血清CFB蛋白检测及Wieslab补体活性测定；进行长达9个月的毒理学研究，涵盖组织分布、脱靶效应评估及标准安全性评价。
- 4.
分析与检测技术：采用茎环定量聚合酶链反应（SL-qPCR）测定组织和血浆中的siRNA浓度；使用蛋白质印迹法或自动化毛细管电泳系统（Jess）检测血清CFB蛋白水平；通过ELISA法测定循环免疫复合物（CIC）浓度；应用RNAscope原位杂交技术和免疫组织化学染色评估关节组织中的基因表达和免疫细胞浸润。
研究结果
CFB对于AP激活必不可少并能放大CP活性
体外实验表明，在正常人血清（NHS）中，酵母聚糖处理可导致Ba片段、C3a、C5a和末端补体复合物的生成，而这些产物的生成在热灭活血清或因子B缺失血清中被消除。此外，热聚集IgG触发的补体激活产物在CFB缺失血清中显著减少，证实了CFB是人血清中AP激活所必需的，并在放大CP中发挥作用。
AZD6912在HuH7细胞系和原代人肝细胞球状体模型中实现靶点特异性CFB信使RNA敲低
AZD6912是一种GalNAc偶联的siRNA，设计用于抑制肝脏CFB表达。在HuH7细胞中，AZD6912在1 nM浓度下即可将CFB表达降低超过90%。对PHH球状体模型的转录组分析显示，AZD6912在所有供体中均呈剂量依赖性地降低CFB信使RNA，且在与临床相关浓度相差10倍范围内未发现真正的杂交依赖性脱靶效应，表明其脱靶风险较低。
替代性GalXC-CFB siRNA在小鼠中诱导肝脏Cfb信使RNA和循环CFB蛋白的剂量依赖性降低
在CD-1小鼠中，单次皮下注射3 mg/kg的替代性siRNA（GalXC-CFB）可实现超过90%的肝脏Cfb信使RNA敲低和超过95%的血清CFB蛋白降低。多次给药方案（每两周一次）可持续抑制肝脏Cfb信使RNA约90%和血清CFB蛋白超过95%，且信使RNA与蛋白的降低具有良好的相关性。
慢性GalXC-CFB siRNA给药未引起组织病理学变化、感染增加或免疫复合物积累
在CD-1和NZB/W F1小鼠中每月一次、连续四个月给予GalXC-CFB后，病毒、细菌和寄生虫检测未发现感染迹象。在易发狼疮的NZB/W F1小鼠中，GalXC-CFB治疗未导致循环免疫复合物的显著积累，也未观察到与治疗相关的组织病理学改变。
PK和生物分布分析确认GalXC-CFB在肝脏中暴露量最高
小鼠PK研究显示，单次给药后GalXC-CFB在肝脏中的暴露量远高于血浆、肾脏和脾脏，且肝脏中浓度在给药后168小时仍维持在较高水平。多次给药研究也证实肝脏暴露量最高，且无蓄积现象。AZD6912在小鼠中的组织分布同样证实其在肝脏中浓度最高，其次是肾脏。
GalXC-CFB siRNA治疗保护小鼠免受炎症和关节损伤
在CAIA模型的预防性研究中，提前7天开始给予GalXC-CFB降低了临床严重程度评分，并减少了后爪的单核细胞浸润和软骨侵蚀。在治疗性研究中，关节炎诱导后第5天或第7天单次给予GalXC-CFB能够逆转临床症状，改善体重恢复，并减少CD45、CD11b和F4/80阳性免疫细胞的浸润。原位杂交显示，GalXC-CFB治疗降低了关节组织中升高的Cfb表达，且肝脏Cfb信使RNA和循环CFB蛋白的降低与治疗效果相关。
AZD6912在非人灵长类动物中有效降低循环CFB并抑制补体活性
在食蟹猴中，单次皮下注射3 mg/kg AZD6912导致肝脏CFB信使RNA最大降低73.6%，循环CFB蛋白最大降低77.9%，并显著抑制了AP活性。多次给药（每四周一次）产生剂量依赖性的肝脏CFB信使RNA降低（64%-82%）和循环CFB蛋白降低（71%-88%），并实现了超过95%的AP活性抑制。长达9个月的毒理学研究显示，高达300 mg/kg的月剂量耐受性良好，无不良发现，肝脏CFB信使RNA降低超过95%，且在8周恢复期后仍未完全恢复。脱靶效应分析表明，AZD6912在体内不影响具有部分序列互补性的其他基因的表达。
讨论与结论
异常补体激活与RA的发病机制有关，关节内补体激活与疾病进展相关。来自RA患者和动物模型的强有力证据推动了AZD6912的开发。GalNAc偶联使得siRNA能够靶向递送至肝脏，AZD6912在肝脏中优先积累，从而实现对全身CFB和补体活性的持续抑制，且无可检测到的脱靶效应。PK/PD研究显示，AZD6912符合典型的GalNAc-siRNA特征：快速的血浆吸收和清除、持久的肝脏暴露、有限的重复给药蓄积以及剂量依赖性ASGPR饱和信号。在CAIA模型中，替代性siRNA治疗减少了临床评分和关节病理，表明系统性CFB降低足以抑制关节病变，即使关节局部也存在Cfb表达。安全性评估未发现感染风险增加或免疫复合物清除受损的证据。总之，在小鼠模型中观察到的CFB敲低疗效，结合AZD6912有利的药理学和安全性数据，强烈支持靶向肝脏CFB作为RA及其他由替代补体途径失调驱动的疾病的新型治疗策略。这些非临床研究的数据为启动一项在健康参与者中评估皮下注射AZD6912的安全性、耐受性、PK和PD的I期临床试验提供了依据。
