摘要：低水平激光疗法（LLLT）由于其能够调节细胞代谢和支持修复过程而在再生医学中的应用日益增多。然而，不同照射参数对成纤维细胞活性的影响尚未完全明了。本研究的目的是评估选定的LLLT参数（808纳米波长，100和200毫瓦功率，2和10焦耳/平方厘米能量密度，脉冲光束）对体外成纤维细胞生物活性的影响。将成纤维细胞暴露于这些设定的参数下，然后评估其粘附细胞和代谢活跃细胞的数量、迁移能力、腺苷酸激酶（AK）和一氧化氮（NO）的水平、细胞因子的分泌、基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的活性以及氧化-抗氧化潜力。结果显示，200毫瓦、2焦耳/平方厘米和100毫瓦、10焦耳/平方厘米的照射参数具有最有利的效果。在这些条件下，观察到粘附细胞和代谢活跃细胞的数量增加，迁移能力增强。此外，AK的释放和NO的分泌减少。LLLT还降低了成纤维细胞中的白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的分泌，并影响了基质金属蛋白酶的活性，这些变化与随后的伤口愈合过程相吻合。此外，LLLT还对维持成纤维细胞的氧化-抗氧化平衡具有积极作用。总之，LLLT对成纤维细胞的影响取决于所应用的照射参数，适当选择的LLLT治疗（200毫瓦、2焦耳/平方厘米和100毫瓦、10焦耳/平方厘米）可以稳定成纤维细胞的代谢，限制其促炎反应，并促进细胞外基质（ECM）的重塑。这些结果证实了LLLT作为支持组织损伤修复过程的有效方法的潜力。
引言：伤口愈合过程分为三个相互重叠的阶段：炎症期、增殖期和重塑期[1]。这些阶段的正常进行决定了皮肤结构和功能完整性的有效恢复。这些阶段之间的平衡失调是一个重要的临床问题，可能导致慢性伤口的形成。由于持续的炎症和异常的细胞外基质（ECM）重塑，治疗此类伤口仍然是一个治疗挑战[2,3,4]。尽管成纤维细胞传统上主要被视为维持皮肤结构的细胞，但越来越多的研究强调了它们在伤口愈合过程中的调节作用[5,6,7]。在炎症期，成纤维细胞分泌促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）和趋化因子（如CCL2和CXCL1），这些因子可以促进白细胞向损伤部位的募集[1, 8, 9]。在增殖期，成纤维细胞与巨噬细胞相互作用，调节它们从M1（促炎）表型向M2（抗炎和修复）表型的转变，从而抑制炎症反应并启动修复过程[10]。在重塑期，这些细胞通过分泌抗炎细胞因子（如转化生长因子β（TGF-β）和白细胞介素10（IL-10）表现出免疫抑制活性。此外，成纤维细胞是基质金属蛋白酶（MMPs）的主要来源，这些酶在调节ECM重塑中起关键作用[11]。成纤维细胞在每个愈合阶段的功能障碍可能会进一步扰乱修复过程，导致再生延迟或病理性瘢痕形成，这在溃疡、压疮或慢性皮肤病中尤为明显[1, 12]。这些机制的复杂性意味着除了药物治疗外，还需要其他方法来支持生理修复过程。其中之一是低水平激光疗法（LLLT），它被认为具有光生物调节（PBM）细胞活性的能力。从机制上讲，PBM的作用主要与线粒体细胞色素c氧化酶（CCO）对辐射的吸收有关，这会导致ATP和活性氧（ROS）的产生变化以及细胞内信号通路的激活。在许多体外研究中，已经证明LLLT可以激活多种细胞内信号通路，包括蛋白激酶B（Akt）、细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun N末端激酶（JNK），这些通路与细胞增殖、迁移、细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）的分泌有关，并可能影响细胞的氧化-抗氧化平衡[13, 14]。因此，LLLT可以通过调节炎症期和增殖期的持续时间和强度，以及支持细胞外基质的重塑和修复过程的启动来影响愈合过程[15]。然而，并非所有研究都证实了LLLT的有益效果，结果之间的差异主要归因于所使用的照射参数的不同，如波长、功率、能量剂量或照射时间。这些参数决定了细胞反应的性质和强度，通常是双相的，这进一步导致了研究结果的不确定性[16, 17]。在一些研究中，观察到激光照射后细胞功能没有显著变化；而在一些报告中则指出有不良影响，如细胞增殖和迁移受到抑制以及氧化应激增加[18, 19]。在我们之前对巨噬细胞的研究中也证实了适当选择参数的重要性，我们发现低能量激光照射以依赖于设置的方式调节巨噬细胞活性，从而产生刺激或细胞毒性效应[20]。根据所使用的LLLT参数和细胞类型观察到的不同效果表明，需要进一步的研究来精确定义能够有效和安全地刺激修复过程的照射条件。因此，本研究的目的是确定优化成纤维细胞反应的LLLT参数，并评估它们对炎症反应、ECM重塑和氧化-抗氧化平衡的影响，这些都是调节皮肤修复过程的重要因素。
材料与方法：
成纤维细胞培养条件：
使用人类成纤维细胞系Hs680（ATCC，美国）在含有10% FBS（Gibco，美国）和1%抗生素溶液（青霉素和链霉素，Sigma-Aldrich，德国）的DMEM培养基（Lonza，美国）中进行培养。实验使用了第5-6代的成纤维细胞。将细胞浓度为0.01百万细胞/毫升的细胞接种到24孔培养板的孔中（Nest SB，美国）。培养在MCO-18AC PhCbi（英国）培养箱中分别维持3天和5天，气氛为5% CO2，温度为37°C。实验期间培养基未更换。为了确定成纤维细胞的分泌活性，在指定的3天和5天培养时间后，收集细胞培养上清液并冷冻（-20°C）以备后续检测。
低能量激光辐射照射：
使用PhysioGo 400 C（ASTAR，波兰）对成纤维细胞进行照射，这是一种产生808纳米波长、100毫瓦或200毫瓦功率、2-10焦耳/细胞孔的电磁辐射的低能量激光。激光以脉冲方式（频率100赫兹，占空比为50%）照射。在光照过程中，培养基的温度没有显著升高。平均温度变化为ΔT = 0.4 ± 0.2°C，相对于基线值（37 ± 0.2°C）。照射在垂直于表面的非接触方式下进行，与细胞的距离至少为1厘米（培养板孔的高度）。
细胞接种：
细胞在第0天接种到培养板上，并在24小时后（第1天）首次进行照射。连续2天、4天或6天每天照射一次。细胞分析在最后一次照射后的第二天（培养的第3天、第5天和第7天）进行（图1）。实验期间培养基未更换。培养结束后，收集细胞和上清液用于进一步的生物学检测。
图1：
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
实验设计和照射时间线的示意图。细胞在第0天（D0）接种到培养板上，24小时后（第1天，D1）进行第一次低水平激光疗法（LLLT）照射。每天用808纳米红外激光（100毫瓦或200毫瓦；2-10焦耳/孔）以脉冲模式（频率100赫兹，占空比为50%）照射一次。连续2天、4天或6天每天照射一次。细胞和生化分析在最后一次照射后的第二天进行（培养的第3天、第5天和第7天）（图1）。
研究阶段：
研究分为两个阶段。第一阶段旨在确定最有利于成纤维细胞生物活性的LLLT参数：(i) 粘附细胞的数量，(ii) 代谢活跃细胞的数量，(iii) 细胞迁移/增殖，(iv) 腺苷酸激酶（AK）的释放，(v) 一氧化氮（NO）的分泌。
第二阶段旨在评估LLLT的潜在免疫调节作用，通过以下指标衡量：(i) 成纤维细胞分泌的促炎和抗炎细胞因子的水平，(ii) 基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，(iii) 细胞的氧化-抗氧化潜力。
细胞数量（CV测试）：
使用结晶紫（CV）测定法评估粘附细胞的总数，反映了细胞粘附和增殖的综合效应。将粘附在基底上的细胞在2%甲醛（PF，Sigma-Aldrich，德国）中固定5分钟，然后用0.5%结晶紫溶解在H2O中的溶液染色5分钟，再用清水冲洗3次。通过向每个培养孔中加入0.5毫升100%甲醇（Linegal Chemicals，波兰）提取细胞吸收的染料。使用FLUOstar Omega读数器（BMG Labtech，德国）在570纳米处测量液体的光密度（O.D.）。
成纤维细胞迁移/增殖（伤口愈合测定）：
使用伤口愈合测定法通过测量随时间变化的间隙闭合情况来评估成纤维细胞迁移和增殖的综合效应。成纤维细胞在配备Culture-Insert 2 Well 24插片的24孔板中培养（ibidi GmbH，Martinsried，德国），这些插件提供了定义明确的500微米无细胞间隙。插件由生物相容性硅胶制成，无需额外基底即可牢固粘附在板表面上[21]。细胞以0.01百万细胞/毫升的密度接种，并在标准培养条件（37°C，5% CO₂）下孵育过夜。孵育后，移除插件并用培养基冲洗细胞以去除非粘附细胞。随后向每个孔中加入1毫升新鲜培养基。实验组的细胞根据所应用的参数进行照射，而对照组（CTR）不进行照射。
摄影记录：
在插件移除后立即（第0天）以及移除后的第3天和第5天使用倒置显微镜（Motic AE-2000T）以10倍放大倍数进行拍摄，配备Moticam-BTU8相机（Motic Europe，西班牙）。所有图像均使用相同的显微镜设置获取。图像分析使用ImageJ软件（NIH，贝塞斯达，MD，美国）进行。无细胞区域被手动标记为感兴趣区域（ROI），并以像素为单位进行测量。伤口闭合的百分比（%）使用以下公式计算：\(\:\text{Wound\:closure\:(\%)}=\frac{{A}_{0}-{A}_{t}}{{A}_{0}}\times\:100\)，其中\(\:{A}_{0}\)代表第0天的平均伤口面积，\(\:{A}_{t}\)代表第3天或第5天的伤口面积。
**ATP依赖性代谢活跃成纤维细胞数量（ViaLight检测）**
为了确定代谢活跃细胞的数量，使用了ViaLight试剂盒（Lonza，瑞士）提供的预制检测方法。简要步骤如下：向含有细胞的孔中加入200 µl细胞裂解试剂和600 µl上清液。孵育10分钟后，将200 µl的上清液-裂解剂混合物转移到一个白色96孔板（Nest SB，美国）中，然后加入200 µl AMR PLUS试剂。2分钟后，使用FLUOstar Omega读数器（BMG Labtech，德国）测量发出的辐射量。
**腺苷酸激酶AK水平（ToxiLight检测）**
为了检测细胞膜损伤和细胞毒性（表现为腺苷酸激酶AK的释放），使用了ToxiLight检测方法。根据制造商的协议（Lonza，瑞士），通过生物发光定量法测定AK水平。简要步骤如下：收集20 µl细胞培养上清液并转移到一个白色96孔板（Nest SB，美国）中，然后向每个孔中加入100 µl AK检测试剂溶液。孵育5分钟后，使用FLUOstar Omega读数器（BMG Labtech，德国）读取发光值。
**一氧化氮（NO）分泌水平（Griess检测）**
为了检测细胞培养上清液中一氧化氮（NO）的释放量，使用了Griess检测方法。将细胞上清液（100 µl）转移到96孔板的孔中，然后加入100 µl试剂混合物（Sigma-Aldrich，德国），该混合物包含Griess A（5%磷酸盐中的1%磺胺酰胺）和Griess B（H2O中的0.1%萘二胺），两者按1:1比例混合。五分钟后，使用FLUOstar Omega读数器（BMG Labtech，德国）在540 nm处读取液体的光密度（O.D.），并根据预先准备的亚硝酸钠校准曲线将这些值转换为NO浓度。
**分泌细胞因子的水平**
通过流式细胞术（Flex Set试剂盒，CBA，BD Biosciences）测量细胞培养上清液中的细胞因子水平。整个检测过程、所有测量和分析均按照Beckman Coulter流式细胞仪（Life Science，美国）提供的细胞因子检测试剂盒中的说明进行。使用了Humane Inflammation Kit（BD Biosciences，美国），该试剂盒可以同时测量六种细胞因子水平：白细胞介素（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12p70（IL-12p70）和肿瘤坏死因子（TNF-α）。数据分析和细胞因子浓度使用Microsoft Excel进行，标准曲线是根据标准品的系列稀释制备的[22]。
**分泌的金属蛋白酶水平**
使用明胶酶谱法（Gelatin zymography）评估基质金属蛋白酶（MMPs）的活性——这些酶是细胞外基质重塑的标志物。通过这种改良的电泳方法，可以评估蛋白水解酶的活性，因为其底物（明胶）被结合到含有十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙烯酰胺凝胶中。该方法可以区分和定量pro-MMP-2、pro-MMP-9以及MMP-2和MMP-9的活性形式。详细的酶谱协议已在之前描述过[20]。
**氧化潜能的测量（PerOx检测 – TOS/TOC）**
使用PerOx检测方法确定细胞的总体氧化状态（TOS/TOC）。根据PerOx（TOS/TOC）试剂盒（Immunodiagnostik AG，Bensheim，德国）提供的使用说明，通过测量脂质过氧化物水平来确定细胞的总体氧化能力（TOS）。详细协议已在之前描述过[23]。
**抗氧化潜能的测量（ImAnOx检测 – TAS/TAC）**
使用ImAnOx检测方法确定细胞的总体抗氧化状态（TAS/TAC）。通过抗氧化剂与已知量的外源性过氧化氢（H2O2）的反应来确定细胞的总体抗氧化状态，根据ImAnOx（TAS/TAC）试剂盒的协议（Immunodiagnostik AG，Bensheim，德国）进行。详细协议已在之前描述过[23]。
**统计分析**
数据以平均值和标准误差的形式呈现。当满足参数测试假设时，使用Student’s t检验确定对照组和研究组之间的差异；当不满足假设时，使用非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验。使用单因素方差分析（ANOVA）比较对照组和研究组之间的差异，随后使用Tukey检验进行事后评估。分析中采用的显著性水平为p ≤ 0.05。使用Microsoft Excel 2007和GraphPad 7（GraphPad Software，圣地亚哥，CA，美国）进行结果的统计和图形分析。
**选择低能量激光辐射照射成纤维细胞的最佳参数**
在实验的后续几天中，对照组（未照射组，CTR组）中的成纤维细胞发生分裂，导致粘附细胞数量增加，与培养第3天相比（图1a）。四次暴露于100 mW激光束（剂量为10 J/cm²，100/10组）和200 mW激光束（剂量为2 J/cm²，200/2组）后，与未照射的对照组（CTR组）相比，培养第5天的粘附成纤维细胞数量增加（图2a）。然而，四次暴露于100 mW激光束（剂量为2 J/cm²，100/2组）的成纤维细胞粘附细胞数量减少。但是，四次照射于200 mW激光束（剂量为10 J/cm²，200/10组）对粘附细胞数量没有影响，与未照射的对照组（CTR组）相比（图2a）。
**脉冲激光束（频率100 Hz，占空比50%）在808 nm波长下对Hs680Tr细胞系中用结晶紫（CV）染色的粘附成纤维细胞数量的影响（图2a），伤口闭合的定量分析（图2b）以及说明伤口闭合的代表性图像（图2c）**。细胞培养指定天数后，用100 mW或200 mW的激光照射，辐射剂量为2 J/cm²/孔。在实验的后续几天（第3天和第5天），用结晶紫对细胞进行染色。在倒置显微镜下以总放大倍数40x（物镜放大倍数（10x）×目镜放大倍数（4x）进行迁移分析，刻度尺为100 µm。伤口愈合程度以相对于第0天测量的初始间隙面积的伤口闭合百分比表示。O.D. - 光密度在570 nm处测量。结果以三次独立实验的平均值±标准误差呈现。*，** - 不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR组）之间的差异（* p<0.05，** p<0.01）。
伤口闭合程度表示为相对于第0天的间隙闭合百分比。在实验的第3天，所有检查组都观察到中等程度的伤口闭合。对照组与基线相比没有显著变化。200/2组和200/10组的间隙闭合显著增加。在100/10组中仅观察到伤口闭合的趋势，而在100/2组中伤口闭合与对照组相似（图2b）。在第5天，所有组（包括对照组）的伤口闭合都显著增加。200/2组的效应最为明显。100/2组也检测到高水平的伤口闭合，而100/10组的反应变化较大（图1b）。图2c展示了说明间隙闭合的代表性图像。
**用100 mW激光束（剂量为10 J/cm²，100/10组）和200 mW激光束（剂量为2 J/cm²，200/2组）照射成纤维细胞后，培养第5天的代谢活跃细胞数量增加。然而，用100 mW激光束（剂量为2 J/cm²，100/2组）和200 mW激光束（剂量为10 J/cm²，200/10组）照射对代谢活跃成纤维细胞数量没有显著影响，与对照组（CTR组）相比（图3）。
**脉冲激光束照射（频率100 Hz，占空比50%）在808 nm波长下对Hs680Tr细胞系中代谢活跃细胞数量的影响**。细胞培养指定天数后，用100 mW或200 mW的激光照射，辐射剂量为2 J/cm²/孔。在实验的第3天和第5天测量ATP依赖性荧光（RLUs – 相对光单位）。结果以三次独立实验的平均值±标准误差呈现。***– 不同参数激光照射的细胞与未照射的对照细胞（CTR组）之间的差异（p<0.01，*** p<0.001）。
无论照射次数如何，在研究的时间内点（培养的第3天和第5天），与未照射的对照组（CTR组）相比，暴露于100 mW激光束（剂量为10 J/cm²，100/10组）和200 mW激光束（剂量为2 J/cm²和200/10组）的细胞显示出AK释放减少。相比之下，用100 mW激光束（剂量为2 J/cm²，100/2组）照射对AK释放没有影响，与对照组（图4a）相比。
**脉冲激光束照射（频率100 Hz，占空比50%）在808 nm波长下对Hs680Tr细胞系中腺苷酸激酶（AK）（图4a）和一氧化氮（NO）（图4b）释放水平的影响**。细胞培养指定天数后，用100 mW或200 mW的激光照射，辐射剂量为2 J/cm²/孔。在实验的接下来第3天和第5天测量AK和NO水平。RLUs - 测光仪通量单位。结果以三次独立实验的平均值±标准误差呈现。*，**，*** - 不同参数激光照射的细胞与未照射的对照细胞（CTR组）之间的差异（*p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001）。
用100 mW激光束（剂量为2 J/cm²，100/2组）照射成纤维细胞两次和四次后，NO分泌量增加，与对照组（CTR组）相比（图4b）。相反，用100 mW激光束（剂量为10 J/cm²，100/10组）和200 mW激光束（剂量为2 J/cm²）照射两次后，在细胞培养的第3天和第5天导致NO分泌减少。用200 mW激光束（剂量为10 J/cm²，200/10组）照射的细胞仅在培养的第3天显示出NO分泌减少，与未照射的细胞组相比（图4b）。
**低强度激光疗法（LLLT）对用100 mW功率和10 J/cm²剂量激光照射的成纤维细胞的细胞因子分泌、MMPs活性和氧化-抗氧化平衡的影响**
对于测试的细胞因子，无论应用何种LLLT参数，四次激光照射在培养第5天都导致IL-6和IL-8的分泌减少（图5a，b）。关于剩余的细胞因子：IL-1β、IL-10、IL-12p70和TNF-α，在所有测试组中均未检测到它们的存在，无论采用何种照射参数和测试时间点（组100/10、200/2和CTR）（图5a、b）。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了脉冲激光束照射（频率100 Hz，占空比50%）在808 nm波长下对Hs680Tr细胞系成纤维细胞分泌的细胞因子IL-6（图5a）和IL-8（图5b）水平的影响，以及荧光标记的细胞因子IL-6和IL-8的流式细胞术分析示例/代表性点图（图5c）。细胞培养了一定天数后，分别以100 mW的功率和10 J/cm²/孔的辐射剂量或200 mW的功率和2 J/cm²/孔的辐射剂量进行激光照射。在实验后的第3天和第5天测量了细胞因子水平。其余参数显示为来自三个独立实验的2-3个代表性样本计算出的平均值±标准误差。*、**、***表示不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR）之间的差异（* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001）。两次100 mW激光束和10 J/cm²剂量的照射使pro-MMP-9及其二聚体形式在培养第3天的水平升高，与未照射的对照组（CTR组）相比。进一步四次相同参数的照射导致培养第5天MMP-2活性升高和pro-MMP-9水平降低（表1）。此外，200 mW激光束和2 J/cm²剂量的照射使培养第5天的pro-MMP-9和MMP-9二聚体水平升高，与对照组（CTR组）相比（表1）。表1显示了LLLT对Hs680Tr细胞系成纤维细胞分泌的MMPs水平的影响。全尺寸表格显示，细胞培养了一定天数后，用808 nm波长、100 Hz频率、50%占空比的脉冲激光束照射，功率输出为100 mW或200 mW，每个孔的能量剂量为2–10 J/cm²（组：100/2、100/10、200/2、200/10）。在实验后的第3天和第5天测量了MMPs的水平。计算了样本中对应于MMP-2、pro-MMP-9二聚体、pro-MMP-9和MMP-9二聚体的峰值面积，并表示为原始平均值（原始体积）。为了定量分析，分析了每个实验组中三个独立实验的一个代表性样本。数据以平均值±标准误差表示；nd – 未检测到（低于方法的检测阈值）；低于检测值的数据在统计分析中视为0。*、**、***表示不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR）之间的差异（* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001）。图6的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了808 nm波长、100 Hz频率、50%占空比的脉冲激光束照射对Hs680Tr成纤维细胞的氧化潜能（图6a）和抗氧化潜能（图6b）的影响。细胞培养了一定天数后，分别用100 mW功率和10 J/cm²/孔的辐射剂量或200 mW功率和2 J/cm²/孔的辐射剂量进行激光照射。在实验后的第3天和第5天测量了氧化潜能（TOS/TOC）和抗氧化潜能（TAS/TAC）。平均值±标准误差。*、**表示不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR）之间的差异（* p<0.05、** p<0.01）。LLLT对Hs680Tr细胞系成纤维细胞分泌的MMPs水平的影响。全尺寸表格显示，细胞培养了一定天数后，用808 nm波长、100 Hz频率、50%占空比的脉冲激光束照射，功率输出为100 mW或200 mW，每个孔的能量剂量为2–10 J/cm²（组：100/2、100/10、200/2、200/10）。在实验后的第3天和第5天测量了MMPs的水平。计算了样本中MMP-2、pro-MMP-9二聚体、pro-MMP-9和MMP-9二聚体的峰值面积，并表示为原始平均值（原始体积）。为了定量分析，分析了每个实验组中三个独立实验的一个代表性样本。数据以平均值±标准误差表示；nd – 未检测到（低于方法的检测阈值）；低于检测值的数据在统计分析中视为0。*、**、***表示不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR）之间的差异（* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001）。LLLT可能通过激活参与伤口愈合的细胞来支持生理修复过程，从而促进组织再生。然而，这种干预的有效性取决于精确选择照射参数，如波长、功率、能量剂量和发射模式，这些参数决定了细胞反应的性质，并使得可重复的治疗方案得以开发[1]。在肌腱炎症模型中，Pires等人证明，780 nm波长（22 mW；7.7 J/cm²）的LLLT显著调节了炎症介质的表达。在急性期和慢性期，LLLT降低了IL-6、环氧化酶2（COX-2）和TGF-β的mRNA水平，而在慢性期减少了编码TNF-α的基因表达[24]。相比之下，Casalechi等人使用类似的模型（780 nm波长，22 mW；7.5 J/cm²）证明LLLT增加了IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA水平，并对MMP-1和MMP-13的水平进行了相位依赖性调节，证实LLLT可以同时调节炎症过程和ECM重塑[25]。尽管许多研究证实了LLLT的有效性，但需要注意的是，不同研究之间协议存在显著差异（波长632-1,100 nm；不同能量剂量0.6–9.6 J/cm²；暴露时间16–600秒；照射次数），并且缺乏明确的照射程序标准[16, 17, 26, 27]。不同研究组使用的LLLT参数的异质性使得难以明确确定照射设置与生物效应之间的关系，这证明了在严格控制条件下进行研究的必要性。在这种情况下，分析对修复过程至关重要的成纤维细胞的反应有助于评估剂量-反应关系，并识别促进再生反应的参数。我们的研究结果表明，成纤维细胞对激光照射的反应取决于所应用的参数。最有利的效果体现在粘附的代谢活跃细胞数量增加，特别是在100 mW/10 J/cm²和200 mW/2 J/cm²的配置下。在伤口愈合实验中，注意到参数依赖性的间隙闭合动态模式。200 mW/2 J/cm² LLLT处理的细胞表现出最明显和持久的效应（表2）。只有两组参数有效，这支持了治疗性生物能量窗口的概念[27, 28]。这种现象很可能与线粒体复合物IV（细胞色素c氧化酶，CCO）的激活有关，导致ATP产生增加，PI3K/Akt通路激活和NF-κB活性抑制，从而促进成纤维细胞的增殖和迁移，并提高其存活率[29, 30]。表2显示了LLLT对Hs680Tr细胞系成纤维细胞反应的影响。全尺寸表格显示，细胞培养了一定天数后，用808 nm波长、100 Hz频率、50%占空比的脉冲激光束照射，功率输出为100 mW或200 mW，每个孔的能量剂量为2–10 J/cm²（组：100/2、100/10、200/2、200/10）。在实验后的第3天和第5天测量了MMPs的水平。计算了样本中MMP-2、pro-MMP-9二聚体、pro-MMP-9和MMP-9二聚体的峰值面积，并表示为原始平均值（原始体积）。为了定量分析，分析了每个实验组中三个独立实验的一个代表性样本。数据以平均值±标准误差表示；nd – 未检测到（低于方法的检测阈值）；低于检测值的数据在统计分析中视为0。*、**、***表示不同参数激光照射的细胞与未照射细胞（CTR）之间的差异（* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001）。讨论表明，LLLT可能通过激活参与伤口愈合的细胞来支持生理修复过程，从而促进组织再生。然而，这种干预的有效性取决于精确选择照射参数，如波长、功率、能量剂量和发射模式，这些参数决定了细胞反应的性质并使可重复的治疗方案得以开发[1]。在肌腱炎症模型中，Pires等人证明，780 nm波长（22 mW；7.7 J/cm²）的LLLT显著调节了炎症介质的表达。在急性期和慢性期，LLLT降低了IL-6、环氧化酶2（COX-2）和TGF-β的mRNA水平，而在慢性期减少了编码TNF-α的基因表达[24]。相比之下，Casalechi等人使用类似的模型（780 nm波长，22 mW；7.5 J/cm²）证明LLLT增加了IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA水平，并对MMP-1和MMP-13的水平进行了相位依赖性调节，证实LLLT可以同时调节炎症过程和ECM重塑[25]。尽管许多研究证实了LLLT的有效性，但需要注意到协议存在显著差异（波长632-1,100 nm；不同能量剂量0.6–9.6 J/cm²；暴露时间16–600秒；照射次数）以及缺乏明确的照射程序标准[16, 17, 26, 27]。不同研究组使用的LLLT参数的异质性使得难以明确确定照射设置与生物效应之间的关系，这证明了在严格控制条件下进行研究的必要性。在这种情况下，分析对修复过程至关重要的成纤维细胞的反应有助于评估剂量-反应关系，并识别促进再生反应的参数。我们的研究结果表明，成纤维细胞对激光照射的反应取决于所应用的参数。最有利的效果体现在粘附的代谢活跃细胞数量增加，特别是在100 mW/10 J/cm²和200 mW/2 J/cm²的配置下。在伤口愈合实验中，注意到参数依赖性的间隙闭合动态模式。200 mW/2 J/cm² LLLT处理的细胞表现出最明显和持久的效应（表2）。只有两组参数有效，这支持了治疗性生物能量窗口的概念[27, 28]。这种现象很可能与线粒体复合物IV（细胞色素c氧化酶，CCO）的激活有关，导致ATP产生增加，PI3K/Akt通路激活和NF-κB活性抑制，从而促进成纤维细胞的增殖和迁移，并提高其存活率[29, 30]。表2显示了LLLT对Hs680Tr细胞系成纤维细胞反应的影响。全尺寸表格显示，Anders等人证实了观察到的效应依赖于照射参数，他们证明810 nm波长（10 mW；5 J/cm²）的照射增加了成纤维细胞的线粒体代谢，而980 nm波长（0.2–5 J/cm²）则降低了其活性。另一方面，在神经元中，980 nm波长的照射产生了剂量依赖性效应；低剂量（2–200 mJ/cm²）刺激了神经突生长，而高剂量没有促进再生的效果[31]。在RAW 264.7巨噬细胞中观察到不同的反应模式，这些巨噬细胞在808 nm波长（100和200 mW；5和10 J/cm²）下照射，200 mW和5 J/cm²的脉冲光束增加了细胞粘附、存活率和NO及TOS的分泌，同时降低了TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）和MMP-9的水平[20]。Brondon等人还表明，在670 nm波长（每次治疗5 J/cm²；总剂量50 J/cm²）下，分次照射影响了Hep-2上皮细胞和L-929成纤维细胞的增殖和代谢，每天两次照射的效果最强[32]。在另一项LLLT治疗研究中，670 nm波长（5 J/cm²/24小时）和6–600 Hz的脉冲频率区分了Hep-2细胞的反应，最大增殖出现在100 Hz频率下[33]。这意味着不仅LLLT的总剂量，其应用方法也决定了生物效应。许多研究证实了LLLT对成纤维细胞粘附、迁移和存活率的波长和剂量依赖性效应。Karimi等人（660、808、915 nm；150–250 mW；2和4 J/cm²）观察到660和915 nm下HGF成纤维细胞的粘附增加，而在808 nm下仅在2 J/cm²时观察到效应[34]。Basso等人证明，780 nm激光光（40 mW；0.5和3 J/cm²）照射后HGF成纤维细胞的迁移和增殖增强[35]。同样，Shaikh-Kader等人报告说，WS1成纤维细胞在660 nm激光束（100 mW；5 J/cm²）照射后迁移增加[36]。Ladiz显示，810 nm（100 mW；0.5 J/cm²）的照射提高了HGF成纤维细胞的存活率，而940 nm在同一剂量下降低了存活率[37]。相比之下，Harorli等人用940 nm波长（40–90 mW；0.84–1.97 J/cm²）的光照射成纤维细胞时，未观察到细胞存活率的变化[38]。总体而言，这些发现进一步支持了LLLT反应的非线性和参数特异性。在我们的研究中，LLLT不仅增强了成纤维细胞的ATP依赖性代谢活性，还影响了它们的膜完整性和炎症状态，表现为AK和NO释放的减少（表2）。过量的NO产生会促进硝基氧化应激和ECM降解[39, 40]。因此，AK和NO水平的同时降低可能反映了LLLT的保护和抗炎效应，可能与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性的抑制和NF-κB信号传导的减少有关[18]。这些发现共同表明，线粒体激活和NO产生的变化可能是观察到的免疫调节效应的相互关联机制。Karu等人描述了光-线粒体相互作用的机制，他们证明NO供体通过作用于细胞色素c氧化酶（CCO）调节HeLa细胞对600–860 nm波长的辐射反应。在820 nm波长下，NO供体的存在消除了辐射诱导的细胞粘附刺激[41, 42]。在我们的结果背景下，这表明NO分泌的变化影响线粒体活性，NO信号传导可能参与LLLT诱导的细胞反应的调节。Kocherova等人观察到，在635 nm波长下用光照射HGF成纤维细胞时NO分泌减少，而在808 nm波长下使用相同的功率和剂量（100 mW，4 J/cm²）时没有变化[43]。然而，George等人获得了不同的结果，他们证明在636和825 nm波长（功率74和104 mW，剂量5–25 J/cm²）下照射原代成纤维细胞后NO分泌增加[44]。总之，这些发现表明NO调节对照射参数非常敏感，可能因波长和剂量配置而异。在评估LLLT对促进组织再生相关成纤维细胞功能的潜在免疫调节效应时，观察到IL-6和IL-8分泌的减少（表3）。IL-6和IL-8是在愈合过程中起重要作用的因素[45, 46]。观察到的IL-6和IL-8分泌减少表明抑制了成纤维细胞的促炎活性，这可能促进从炎症阶段向增殖阶段的转变。这种模式与光生物调节的双相剂量反应特征一致。表3 LLLT对Hs680Tr细胞系成纤维细胞中细胞因子、MMP活性和氧化-抗氧化平衡的影响
与本研究报道的结果相似，Shaikh-Kader等人也发现WS1成纤维细胞在暴露于660纳米波长、100毫瓦功率和5焦耳/平方厘米剂量的光后，IL-6的分泌量减少[36]。相比之下，Harorli等人研究了940纳米波长（功率40-90毫瓦，剂量0.84-1.97焦耳/平方厘米）的照射对成纤维细胞的影响，结果显示1.97焦耳/平方厘米的剂量抑制了IL-6和IL-8细胞因子的释放，而较低剂量（0.84-1.4焦耳/平方厘米）则导致这些细胞因子的分泌增加[38]。一些作者还提出，光生物调节可能通过表观遗传机制影响炎症信号传导，包括microRNA的调节；然而，这一方面需要进一步的专门机制研究[38]。
使用较低功率（100毫瓦）和较高剂量（10焦耳/平方厘米）照射成纤维细胞时，pro-MMP-9及其二聚体形式在第三天出现短暂增加，随后MMP-2活性在第五天增加（表3）。这表明蛋白水解过程受到控制并呈顺序性激活，这是正常炎症和再生阶段的典型特征。相反，较高功率（200毫瓦）和较低剂量（5焦耳/平方厘米）并未影响MMP-2活性，pro-MMP-9和MMP-9二聚体的激活也延迟到第五天（表3）。因此，100毫瓦和10焦耳/平方厘米的照射参数似乎对再生过程更有益，因为它们促进了短期的蛋白水解活性和随后的细胞外基质（ECM）重塑，反映了平衡的愈合过程。这些效应可能与MAPK/ERK和PI3K/Akt通路的调节有关，这种调节方式取决于细胞的氧化和炎症状态[18, 29, 47]。
我们研究中观察到的NO以及IL-6和IL-8细胞因子分泌量减少可能表明，所使用的LLLT参数限制了过度的炎症细胞活性，有利于维持更倾向于再生的环境而非促炎环境。在这种条件下，MMP-9的活性可能以受控的方式发生，足以早期“清除”受损的ECM成分，但不会导致过度降解，而随后MMP-2活性的增加可能反映了细胞从炎症阶段向ECM重塑阶段的转变。多位作者研究了LLLT对MMP活性的影响。Sassoli等人发现，用635纳米波长（功率89毫瓦，剂量0.3焦耳/平方厘米）的光照射NIH/3T3成纤维细胞可以增加MMP-2和MMP-9的表达[35]。同样，Illescas-Montes等人观察到CCD-1064Sk成纤维细胞在暴露于940纳米光（功率0.5瓦，剂量4焦耳/平方厘米）后MMP-2表达显著增加[48]。然而，Yang等人的研究结果不同，他们发现应用633纳米光（3毫瓦/平方厘米）后成纤维细胞中的MMP-2和MMP-9表达减少[49]。
成纤维细胞对LLLT反应的一个重要方面是氧化应激的减少和抗氧化活性的增加，这有助于维持氧化还原平衡和修复过程。当使用100毫瓦功率和10焦耳/平方厘米的剂量照射成纤维细胞时，氧化潜能降低，同时抗氧化潜能增加。然而，当使用200毫瓦功率和2焦耳/平方厘米的剂量时，抗氧化潜能显著增加（表3）。这些结果表明，适当选择的LLLT参数可以促进有利于组织再生的氧化-抗氧化平衡。这种现象的机制可能与Nrf2通路的激活以及抗氧化酶（如SOD和GPx）的表达增加有关，同时限制了活性氧（ROS）的过度产生[50, 51]。George等人也观察到类似的结果，他们使用636纳米和825纳米波长（功率分别为74毫瓦和104毫瓦，剂量分别为5-25焦耳/平方厘米）的光，发现636纳米波长减少了ROS的分泌，而825纳米波长则增加了ROS的产生[44]。Baldassarro等人证明，645纳米波长（功率11毫瓦）的光可以降低成纤维细胞的氧化潜能，同时增加其抗氧化潜能[52]。
细胞培养指定天数后，用脉冲激光束（频率100赫兹，占空比50%）进行照射，激光波长为808纳米，功率输出为100或200毫瓦，每个含有细胞的孔的能量剂量为2-10焦耳/平方厘米（组别：100/2、100/10、200/2、200/10）。在实验的第3天和第5天，测量了以下参数：粘附细胞数量（CV）、代谢活跃细胞数量、腺苷酸激酶（AK）水平和一氧化氮（NO）水平。不同激光参数的照射组与未照射对照组之间的统计学显著差异用箭头表示，其中↑表示增加，↓表示减少，-表示无统计学显著差异。
细胞培养指定天数后，用脉冲激光束（频率100赫兹，占空比50%）进行照射，激光波长为808纳米，功率输出为100毫瓦，每个含有细胞的孔的能量剂量为10焦耳/平方厘米；同时也用功率输出为200毫瓦，每个含有细胞的孔的能量剂量为2焦耳/平方厘米（组别：100/10和200/2）。在实验的第3天和第5天，测定了细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10、IL-12p70、TNF-α）、金属蛋白酶（MMP-2、pro-MMP-9）的水平，以及细胞的氧化（TOS/TOC）和抗氧化（TAS/TAC）潜能。不同激光参数的照射组与未照射对照组之间的统计学显著差异用箭头表示，其中↑表示增加，↓表示减少，-表示无统计学显著差异。
结论
我们确认成纤维细胞对LLLT的反应密切依赖于照射参数。在分析的细胞模型中，当细胞以200毫瓦；2焦耳/平方厘米和100毫瓦；10焦耳/平方厘米的参数进行照射时，获得了最有益的效果。结果表明，适当选择的辐射设置可以调节炎症活性、细胞外基质重塑和氧化-抗氧化平衡，从而在体外培养中促进细胞的再生功能特性。
**局限性**
实验独立进行了三次重复；然而，它们是在同一成纤维细胞系中进行的，这意味着生物学模型仅限于单一细胞来源。因此，这可能会影响结果的普遍性，并限制其在更广泛生物学背景下的解释。此外，体外单培养模型无法反映愈合过程中涉及的复杂细胞间相互作用。因此，未来的研究应包括独立的生物学模型和更复杂的实验系统，包括共培养模型和体内研究，以确定所选的LLLT参数是否在组织和整个生物体水平上产生效应。
