泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）是通过泛素介导方式调控蛋白质稳态的基本机制。在细胞周期进程中，UPS在调节关键细胞周期调控因子（包括细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinase, CDK）抑制剂和检查点蛋白）方面发挥着核心作用。通过E3泛素连接酶（如后期促进复合物/环体（Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome, APC/C）和Skp1-Cullin1-F-box（SCF）复合物）的协调作用，细胞周期蛋白的适时降解确保了正确的细胞周期转换、DNA复制和有丝分裂保真性。UPS组分的失调与多种病理状况相关，包括癌症，其中关键细胞周期调控因子的异常稳定或过早降解破坏了正常的细胞增殖。本综述全面概述了UPS在细胞周期控制中的作用，重点阐述了泛素化和降解的分子机制、关键的调控性E3连接酶和去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes, DUBs），以及靶向UPS在细胞周期相关疾病中的治疗潜力。
细胞周期（Cell cycle）是一个对细胞增殖和生物体发育至关重要的基本生物学过程，在此过程中一个细胞分裂成两个基因相同的子细胞。这一过程的保真性，确保了遗传物质的准确复制和均等分配，对维持基因组稳定性和细胞稳态至关重要[1]。细胞周期机制的异常或突变导致不受控制的增殖，这是肿瘤转化和癌症发展的主要驱动力[2]。在过去几十年中，研究发现细胞周期进程主要由细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDK Inhibitors, CKIs）等细胞周期调控因子驱动，为理解细胞周期进程提供了精确的机制。近年研究发现，细胞周期相关蛋白主要经历两类翻译后修饰（Post-Translational Modification, PTM），即磷酸化和泛素化，从而允许细胞周期正常进程[3]。
细胞蛋白质稳态的维持主要受泛素-蛋白酶体系统（UPS）支配，这是蛋白质降解的主要途径[4]。UPS确保对蛋白质周转的高度特异性和精确调控，从而控制众多信号通路。UPS围绕泛素（ubiquitin）分为泛素化和去泛素化过程，泛素是由76个氨基酸组成的小分子，作为降解标签发挥作用[5]。
在细胞周期调控的复杂网络中，关键蛋白的适时周转是有序进程的基本要求[6]。这种细胞周期各阶段之间的高保真转换由多种因素确保，包括众多E3泛素连接酶和去泛素化酶（DUBs），它们共同协调细胞周期相关蛋白的精确降解和稳定。在这些多样化的因子中，两个多亚基E3泛素连接酶复合物——Skp1-Cullin-F-box（SCF）复合物和后期促进复合物/环体（APC/C）——脱颖而出，成为主要的主调控因子。通过集中控制关键细胞周期蛋白和抑制剂的蛋白水解，这两个复合物成为驱动细胞周期机制并保障其时间准确性的主要引擎[7]。
然而，细胞周期的复杂性远不止这两个复合物；多种其他E3连接酶和DUBs在调控细胞周期相关蛋白方面也发挥着重要作用。这种集体调控机制维持了基因组完整性和细胞命运所必需的蛋白质稳态平衡。因此，理解UPS的功能多样性至关重要，因为靶向其活性提供了一种有前景的治疗策略。
细胞周期阶段
有丝分裂细胞周期包括两个主要阶段：间期（interphase）和有丝分裂期（Mitosis, M期）[7], [8]。间期允许基因组复制与其分离在时间上分开，确保每个子细胞继承一份相同的遗传物质副本。间期事件的适当调控对于预防基因组不稳定性和疾病至关重要。间期涵盖细胞周期的大部分时间，并细分为三个不同的阶段：间隙1期（Gap 1, G1期）、DNA合成期（DNA synthesis, S期）和间隙2期（Gap 2, G2期）。G1期发生在有丝分裂之后，代表细胞生长和代谢活动的时期，这将确保有足够的时间进行DNA复制。在此阶段，细胞评估环境条件和细胞内信号，以确定是否进行DNA复制[9]。G1期检查点（也称为限制点，Restriction point）对于承诺进入S期至关重要。S期的特点是DNA复制的启动和进行[10]。在此期间，所有染色体被复制，形成姐妹染色单体。这一过程高度协调并受到监控以确保准确性，因为复制错误可导致突变或染色体异常[10], [11]。DNA合成后，G2期作为有丝分裂的准备阶段。在G2期，细胞继续生长，产生有丝分裂纺锤体组装所必需的蛋白质，并检查基因组是否存在DNA损伤或不完全复制。G2/M检查点确保细胞不会在DNA受损或未完成复制的情况下进入有丝分裂[11]。有丝分裂是细胞周期的最后阶段，在此期间复制的DNA被精确分离到两个子细胞中。它被分为四个连续的亚阶段：前期、中期、后期和末期[12], [13]。在前期，染色质凝缩成可见的染色体，有丝分裂纺锤体装置开始形成。随后的中期以核膜破裂和染色体沿赤道板精确排列为标志，通过纺锤体微管附着到着丝点来维持。在后期，姐妹染色单体同步分离并迁移到相反的纺锤体极。在末期，核膜在分离的染色体周围重新组装，随后解凝为染色质[14], [15]。有丝分裂以胞质分裂（cytokinesis）完成，即细胞质的物理分离，产生两个基因相同的子细胞[16], [17]。完成一个细胞周期后，细胞进入G1期为下一个周期做准备。然而，如果细胞外或细胞内条件，包括生长因子、营养物质或增殖信号不足，细胞不会进入S期。相反，它进入一种可逆的静止状态，称为G0期（静止期，quiescence）。增殖与静止之间的这一基本决策在G1期检查点做出，称为限制点[18]。
细胞周期检查点
细胞周期的主要目的是通过细胞分裂忠实地复制整个基因组，并将基因相同的染色体副本分配到两个子细胞中[8]。这一至关重要的过程，包括精确的DNA复制和随后的染色体分离，需要绝对的保真度以确保遗传稳定性。为了保护遗传完整性，细胞利用一种被称为细胞周期检查点的强大监视系统[19], [20]。细胞周期检查点位于三个战略控制点：G1检查点、G2检查点和纺锤体组装检查点（Spindle Assembly Checkpoint, SAC，也称为有丝分裂检查点）。每个细胞周期检查点确保细胞仅在所有先决条件都满足时才进展到下一阶段。在G1期晚期激活的G1检查点验证细胞是否具有足够的营养和生长因子来启动DNA复制，并且在进入S期之前基因组是否无损伤[21]。一旦细胞通过此检查点，它们就在S期进行DNA复制并进入G2期。在G2期结束时激活的G2检查点充当关键的监视机制，确保[1] DNA复制已成功完成，且[2] 无DNA损伤或异常结构残留[22], [23]。如果检测到错误，DNA损伤反应（DNA Damage Response, DDR）通路会立即被激活。持续的、未修复的损伤导致细胞周期阻滞或凋亡[24]。在有丝分裂期间发挥功能的SAC，通过监控纺锤体微管附着到着丝点和姐妹染色单体间张力的建立，确保染色体的精确分离[25], [26]。这可以防止染色体错误分离和非整倍体[19], [27]。总而言之，细胞周期检查点是关键的监视系统，通过检测和纠正每个阶段发生的错误，保证细胞周期的准确进程和基因组完整性的维持[28]。它们的功能受到多种信号通路和关键调控蛋白的严格调控，包括CDKs、Chk1/2、极光激酶（aurora kinase）、Bub和Mad。这些蛋白的功能障碍会破坏检查点的完整性，导致基因异常和突变，从而损害细胞周期控制。因此，检查点功能的适当失败会导致不受控制的细胞增殖和凋亡逃逸，最终驱动肿瘤转化[29]。
细胞周期调控因子的动力学：从细胞周期蛋白-CDK-CKI轴到主E3连接酶
细胞周期蛋白（Cyclins）、CDKs和CKIs是细胞周期的主要调控因子。这些蛋白形成特定的复合物，其活性在细胞周期的特定阶段达到峰值[23], [30]。CDKs属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，人类基因组中有21个基因编码20种CDKs（CDK11由两个不同的基因CDK11A和CDK11B编码）。其中，只有CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6直接参与细胞周期调控[31]。尽管这些CDKs在静止细胞和增殖细胞中均有表达，但它们在结合到相应的细胞周期蛋白并经历CDK激活激酶（CDK-activating kinase, CAK）复合物的激活磷酸化之前保持无活性[32]。CDK的活性受到多种机制的严格调控，包括磷酸化状态、细胞周期蛋白可用性以及与CKIs的结合。细胞周期蛋白作为关键调控因子，其水平在细胞周期中周期性波动。在各种细胞周期蛋白家族中，细胞周期蛋白A、B、D和E主要参与细胞周期进程，每种在特定阶段达到峰值[33], [34]。每种类型的细胞周期蛋白在特定阶段合成，通过与CDKs形成复合物来驱动细胞周期进程，一旦其功能完成，随后通过泛素介导的降解。例如，D型细胞周期蛋白通过与CDK4/6形成复合物并表达在G1期达到峰值，促进G1检查点转换[35]，而细胞周期蛋白B与CDK1结合形成成熟促进因子（Maturation-Promoting Factor, MPF）复合物，驱动有丝分裂进入和进程[36], [37]。这些CDK/细胞周期蛋白复合物的活性受到两大类细胞周期抑制剂的严格调控：CDK相互作用蛋白/激酶抑制剂蛋白（CDK-Interacting Protein/Kinase Inhibitor Protein, CIP/KIP）家族和INK4家族[38], [39]。包含p16
INK4a、p15
INK4b、p18
INK4c和p19
INK4d的INK4家族特异性结合CDK4或CDK6，阻止它们与细胞周期蛋白D结合。相比之下，CIP/KIP家族成员，包括p21
CIP、p27
KIP1和p57
KIP2，可以同时结合CDKs和细胞周期蛋白，从而调控多种CDK-细胞周期蛋白复合物的活性[40]。
然而，这些核心调控因子的程序性振荡和功能周转并非内在属性；而是由更高阶的调控网络严格决定的。该系统的核心是两个主E3泛素连接酶复合物的时间调控逻辑：主要调控从G1晚期到G2期转换的SCF复合物，以及在有丝分裂期间接管以确保精确染色体分离和有丝分裂退出的APC/C。一个关键的调控轴涉及SCF
Skp2，它在G1/S转换时靶向p21和p27进行降解，从而促进CDK2活性[41], [42]。另一方面，APC/C由其共激活因子Cdc20和Cdh1顺序调控，驱动关键有丝分裂底物（如细胞周期蛋白B和PLK1）的降解，从而促进不可逆的有丝分裂退出和重新进入G1期。这一转换通过一个强大的抑制性回路得到保障。在有丝分裂后期和G1早期，APC/C
Cdh1靶向Skp2进行降解。通过对SCF复合物的F-box蛋白进行泛素化和降解，APC/C允许CKIs重新积累，有效地将细胞重置在G1期。相反，当细胞准备进入S期时，SCF
Skp2促进Cdh1的泛素化，从而抑制APC/C活性以允许S期细胞周期蛋白的积累[6], [43]。
这些核心调控因子之间的精确相互作用对于确保正确的进程和检查点控制至关重要。这些蛋白的异常表达、突变或功能破坏是恶性肿瘤的标志，经常导致不受控制的细胞增殖和癌基因转化[44], [45]。为了维持蛋白质稳态并确保细胞周期的方向性，这些核心调控因子的活性和丰度受两种类型的蛋白质修饰调控：磷酸化和泛素化[46], [47], [48]。虽然可逆的磷酸化作为调节蛋白质活性的关键开关，但泛素化对于靶向降解受损或错误折叠的蛋白质至关重要[49], [50]。特别是，泛素介导的蛋白水解在控制细胞周期进程方面发挥着核心作用，凸显了泛素-蛋白酶体系统（UPS）在维持细胞周期蛋白质稳态中的基本功能。
泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system, UPS）是一个主要的翻译后修饰过程，调控超过80%的细胞内蛋白质降解，从而维持蛋白质稳态[51]。UPS活性由泛素化和去泛素化之间的平衡控制，这是一个动态且可逆的过程。
泛素化
泛素化涉及三种酶的序贯作用：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶，后者催化将泛素——一种76个氨基酸的蛋白质——连接到底物蛋白上[52], [53]。该过程始于泛素被E1以ATP依赖性方式激活，形成硫酯键。然后泛素通过转硫酯反应转移到E2上，最后，通过E3连接酶的作用连接到底物蛋白的赖氨酸残基上[54], [55]。迄今为止，已知人类基因组编码超过600种E3连接酶，根据其结构域和泛素转移机制分为四个主要家族：Really Interesting New Gene（RING）家族、E6AP C末端同源物（HECT）家族、RING-间隔-RING（RBR）家族和U-box家族[56]。RING和U-box家族通过其保守的RING结构域和U-box结构域，分别将连接在E2酶上的泛素直接转移到底物。相比之下，HECT和RBR家族将泛素间接转移到底物。HECT E3连接酶首先在其双叶HECT结构域内的催化性半胱氨酸残基上接受泛素，然后将其转移到底物。类似地，RBR E3连接酶采用涉及两个RING结构域的两步机制：第一个（RING1）结合E2-泛素复合物，第二个（RING2）包含活性位点半胱氨酸，在泛素转移到底物之前接受泛素[57], [58]。
去泛素化（Deubiquitination）
泛素可以通过七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）或泛素自身的N端甲硫氨酸（M1）的连接形成多聚泛素链[59]。泛素连接的类型决定了底物蛋白的命运和功能。K11-和K48连接的链通常发出蛋白酶体降解的信号，而其他连接则介导非蛋白水解功能，如DNA修复、细胞周期调控、自噬和细胞内信号传导[60]。例如，M1连接的链通过NF-κB通路参与炎症反应，K6和K27与DNA修复有关，K29与细胞周期调控有关，K33与高尔基体后运输有关，K63与自噬和免疫反应有关[61], [62]。近年研究揭示了同型泛素链（通过单一赖氨酸连接）和异型链（包括混合或分支连接）[63], [64]。然而，许多这类链类型的形成机制和具体生物学功能仍不清楚，是当前研究的主题。
去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes, DUBs）通过从底物蛋白上去除泛素部分来逆转泛素化。已鉴定出超过100种DUBs，分为两大类：半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶包括八个家族：泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-specific proteases, USPs）、泛素C端水解酶（Ubiquitin C-terminal hydrolases, UCHs）、卵巢肿瘤蛋白酶（Ovarian tumor proteases, OTUs）、Machado-Joseph病蛋白结构域蛋白酶（MJDs）、含MIU的新型DUB家族（MINDY）、单核细胞趋化蛋白诱导蛋白（MCPIPs）、dsDNA病毒和真核生物的排列式木瓜蛋白酶折叠肽酶（PPPDEs）以及具有UFM1特异性肽酶结构域的锌指蛋白（ZUFSPs）[4], [65]。
UPS通过泛素化和去泛素化之间严格调控的平衡来维持蛋白质稳态。E3连接酶和DUBs的失调（通过异常表达或基因突变）与包括癌症在内的多种疾病相关[66], [67]。近年研究强调了这些酶在细胞周期调控中的关键作用，特别是在控制检查点功能和阶段转换方面[5], [68], [69]。由于细胞周期是一个高度协调的过程，需要在无任何错误的情况下及时进展和精确决策，因此其调控蛋白必须受到严格且通常是不可逆的调控。例如，细胞周期蛋白在细胞周期的特定阶段表达，一旦其功能完成就必须迅速降解；破坏这种振荡性表达模式可导致异常的细胞分裂。因此，关键细胞周期调控因子的不可逆周转对于忠实的细胞周期进程至关重要。UPS通过介导每个阶段调控蛋白的适时降解来确保这一过程，从而实现有序的向下一阶段转换。这种调控模式与可逆变化（如磷酸化）有本质区别，后者短暂地调节蛋白质活性而不消除蛋白质本身。此外，UPS提供了比转录调控更快的控制水平，通过直接管理蛋白质水平。通过快速蛋白质降解，细胞可以在几分钟内重塑其蛋白质组，达到仅通过转录无法实现的时间精度。因此，UPS不仅仅是支持细胞周期；它是驱动细胞分裂方向性和有序进程的基本分子引擎。
本综述探讨了E3连接酶和DUBs在细胞周期控制中的生理作用，并强调了靶向UPS作为细胞周期相关疾病和癌症治疗策略的潜力。
UPS介导的细胞周期调控
细胞周期进程受到关键调控因子的严格控制，它们的协调合成、激活和降解确保了通过细胞周期不同阶段的精确转换[6], [70]。这些核心细胞周期调控因子主要受UPS机制控制（图3），UPS通过促进关键细胞周期调控因子的降解或稳定来调控细胞周期动态。
G1进入和G1/S转换的调控
在细胞周期的早期阶段，特别是从G0到G1的转换，细胞向分裂的承诺是由D型细胞周期蛋白及其催化伙伴CDK4和CDK6的适时表达和积累驱动的。随着细胞通过G1期并接近限制点，细胞周期蛋白E积累并与CDK2形成活性复合物，从而促进进入S期。这些细胞周期蛋白-CDK复合物的活性受到CKIs（特别是p21和p27）的严格控制，它们结合并抑制细胞周期蛋白-CDK活性以确保适当的检查点控制[40]。
E3连接酶和DUBs对细胞周期蛋白和CDK的控制
据报道，细胞周期蛋白D的E3连接酶介导的降解依赖于Thr286磷酸化[114]。几种E3连接酶，包括β-TrCP、APC/C和F-box蛋白（FBPs），泛素化细胞周期蛋白D1以确保适当的细胞周期调控，特别是在G1/S转换期间。然而，这些E3连接酶的功能突变或异常表达可导致细胞周期蛋白D积累，从而导致不受控制的细胞增殖和肿瘤发展[115]。F-box蛋白25和32（FBXO25和FBXO32）通过不同的机制调节细胞周期蛋白D1来调控细胞周期。FBXO25在皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC）中间接调控细胞周期蛋白D1的表达。FBXO25通过与细胞周期蛋白D1的转录抑制因子Oct-1结合，增强细胞周期蛋白D1的表达，从而促进cSCC的肿瘤发生和转移[77]。另一方面，FBXO32直接相互作用并泛素化所有三种类型的细胞周期蛋白D亚型，形成K29连接的多聚泛素链。有趣的是，FBXO32识别去磷酸化的细胞周期蛋白D，从而延长其半衰期，并通过上调CDK4/6活性驱动肿瘤进展和转移[78]。七种不同的cullin（CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5, 和7）和cullin相关E3连接酶（KEAP1, DDB2, 和WSB2）与细胞周期蛋白D1相互作用，通过以磷酸化依赖的方式对其进行泛素化，促进降解，从而阻碍G1到S期的转换和细胞周期进程[79]。DAZ相互作用锌指蛋白3（DZIP3，也称为hRUL138）是一种RNA结合的RING E3连接酶（RBRL），作为E3泛素连接酶参与细胞周期蛋白D1的调控。DZIP3在多种癌症类型（包括乳腺癌）中上调，其缺失使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制癌细胞增殖和转移。在机制上，DZIP3通过与细胞周期蛋白D1 mRNA的3'非翻译区（UTR）相互作用并形成K63连接的多聚泛素化，在转录和蛋白质水平上增强细胞周期蛋白D1的稳定性[80]。
相反，几种DUBs对抗E3连接酶介导的细胞周期蛋白D的泛素化，从而减少其泛素标记并防止其降解。USP2、USP5、USP12、USP27X和USP32通过在不同癌症中调节细胞周期蛋白D的转录水平，被证明参与细胞周期调控。这些DUBs的敲低降低了细胞周期蛋白D和CDK4的表达，从而诱导G1期细胞周期阻滞。然而，这些酶调控细胞周期蛋白D的确切机制仍有待完全阐明。特别是，尚不清楚这些DUBs是否直接去泛素化细胞周期蛋白D，如果是，涉及哪些赖氨酸残基或多聚泛素链类型。因此，需要进一步的机制研究来阐明其调控作用[71], [72], [73], [74], [75], [81], [82], [88]。相比之下，USP10和USP13通过去除K48连接的多聚泛素链，直接稳定细胞周期蛋白D，从而在胃癌（GC）和胶质母细胞瘤中促进细胞周期进程。由于K48连接的泛素化是蛋白酶体降解的典型信号，USP10和USP13的去泛素化防止了细胞周期蛋白D的周转，从而增加其稳定性并促进G1期进程和肿瘤发生[83], [84], [85]。特别是，USP10以独立于Thr283磷酸化的方式调控细胞周期蛋白D3，而这种磷酸化修饰与其蛋白酶体降解密切相关。值得注意的是，USP10可以进一步稳定T283A突变体，在该突变中，磷酸化位点的缺失通过去泛素化从本质上增强了蛋白质稳定性和活性。通过防止野生型和突变型形式的降解，USP10显著增强了骨髓瘤中细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物的活性，从而加速细胞周期进程[84]。虽然E3连接酶和DUBs传统上被视为底物稳定性的拮抗性调控因子，但新证据表明它们也可以合作调控共同靶点。一个代表性的例子是急性髓系白血病（AML）中E3连接酶RNF220和USP22之间的功能相互作用。这两种酶协同工作，以独立于Thr283磷酸化的方式增强细胞周期蛋白D1的稳定性，从而促进G1期进程和细胞增殖[86], [87]。
UPS介导的p21/p27轴的调控
细胞周期进程不仅受到细胞周期蛋白/CDK复合物激活的调控，还受到CKIs（如p21和p27）适时降解或稳定的调控。由于这些CKIs是细胞周期进程的关键调控因子，它们受UPS的调控是细胞命运的关键决定因素[116]。OTUB1通过IFN-γ诱导的激活调控p27稳定性。IFN-γ刺激激活JAK/Src信号通路，导致OTUB1在Tyr26位点磷酸化。这种修饰增强了OTUB1对p27进行去泛素化的能力，从而显著提高其蛋白质稳定性。有趣的是，与主要依赖其催化蛋白酶活性的常规DUBs不同，OTUB1也可以通过非规范机制发挥作用。磷酸化的OTUB1不是直接切割泛素链，而是结合E2泛素结合酶并将其与底物隔离，从而抑制泛素转移。通过这种机制，OTUB1抑制p27的泛素化，提高p27表达，并强化G0/G1细胞周期阻滞[76]。Skp2是另一个参与细胞周期调控的关键E3连接酶，主要通过靶向p27和细胞周期蛋白E进行泛素介导的降解，以促进G1到S期的转换。Skp2的缺失导致严重的染色体异常，包括细胞周期失调、多倍体和中心体过度复制，这些通常与肿瘤发生相关[41], [42]。另一种CKI，p21，受USP11和USP44调控以维持细胞周期完整性。这两种DUBs都通过特异性去除K48连接的多聚泛素链来增强p21稳定性。值得注意的是，USP11在DNA损伤反应中显著增强p21的去泛素化，从而强化检查点控制和细胞周期阻滞。USP11还拮抗多种参与p21降解的E3连接酶，包括APC/C
CDC20、SCF
SKP2和CRL4
Cdt2，从而能够在不依赖细胞周期阶段的情况下有效调控p21。相比之下，USP44的表达经常在甲状腺癌中因启动子高甲基化而下调。USP44的缺失破坏了适当的检查点调控，导致异常的G1期进程和不受控制的细胞增殖。这些发现强调，UPS组分不仅是细胞周期蛋白的调控因子，它们自身也受到更高阶调控机制（如表观遗传修饰）的调控，进一步增加了肿瘤发生过程中细胞周期控制的复杂性[91], [92]。TRIM22和TRIM39也通过不同的机制经由p21调控细胞周期进程。TRIM22通过催化多聚泛素链形成促进p21的蛋白酶体降解，从而恢复CDK和细胞周期蛋白活性并促进细胞周期进程。相比之下，TRIM39通过减弱p21与Cdt2的相互作用来稳定p21，从而抑制CRL4
Cdt2 E3连接酶介导的泛素化和降解[93], [94]。
总之，G1期进程和G1/S转换的调控例证了E3连接酶和DUBs之间高度协调的相互作用，它们可以作为拮抗性调控因子或合作伙伴发挥作用。关键细胞周期蛋白的功能命运不仅取决于它们的表达水平，还取决于精确的泛素化模式，包括特定的靶向残基和多聚泛素链连接类型。这些泛素依赖性修饰最终决定蛋白质是经历蛋白酶体降解还是功能稳定化，从而确保准确和及时的细胞周期进程。
S期和G2期的调控
虽然细胞周期蛋白A在S期达到其生理峰值，但从G1晚期开始的适时积累对于G1/S转换至关重要。因此，DUBs对细胞周期蛋白A的异常稳定化会破坏正常的细胞周期，导致过早的S期进入和不受控制的细胞增殖。已知几种DUBs通过调节细胞周期蛋白A的表达和稳定性来调控S期进入[88], [95], [96], [97], [117]。有趣的是，USP17和USP37的表达专门用于启动G1/S转换，通过稳定细胞周期蛋白A促进S期进入。USP17在G0期几乎检测不到，在G1/S边界达到表达峰值，随后随着细胞进入S期而下降。USP17的缺失通过稳定CKIs损害S期进入，从而阻断细胞周期进程[95], [97]。类似地，USP37的表达受E2F转录上调，而其对细胞周期蛋白A的去泛素化活性由CDK2介导的磷酸化激活。由于APC/C
Cdh1复合物主要催化K11和K48连接的多聚泛素链，USP37通过选择性去除这些与降解相关的泛素连接来促进细胞周期蛋白A的稳定性。此外，USP37直接与Cdh1相互作用，从而保护细胞周期蛋白A免受APC/C介导的泛素化，允许正常的S期进入。值得注意的是，USP37本身随后通过APC/C
Cdh1复合物介导的K11连接泛素化被靶向降解[96]。这些发现强调，E3连接酶和DUBs不仅仅是简单的竞争性拮抗剂，而是进行动态的相互作用以确保精确的底物调控。细胞周期调控因子的最终命运取决于泛素化和去泛素化活性之间的转变平衡，这种平衡在特定阶段是紧密协调的。一个DUB可能在一个阶段暂时占主导地位以稳定底物，而在下一个阶段被促进其适时降解的E3连接酶所取代。这种通常由特定PTM触发的酶学主导地位的协调转换，对于维持细胞周期的单向性和时间准确性至关重要。
AKT介导的磷酸化增强了细胞周期蛋白F的稳定性和活性，有助于细胞周期进程，特别是S期进入[118]。相反，Cdh1通过APC/C介导的泛素化诱导细胞周期蛋白F降解，从而阻止S期进入。有趣的是，Cdh1也作为细胞周期蛋白F的受体，反之亦然，表明这两种泛素连接酶在细胞周期控制中存在相互反馈回路[43]。USP7特异性调控细胞周期蛋白F的稳定性，它们之间的相互作用在DNA损伤剂诱导的基因毒性应激下减弱[98]。在一项近期研究中，FBXO22和CRL4
BDCAF1被报道促进p21的降解。FBXO22通过其F-box结构域与p21结合，作为负调控因子促进其降解，而由CUL4B、RBX1和DDB1组成的CRL4B与DCAF11形成复合物，后者特异性识别p21进行泛素化。FBXO22和CRL4
BDCAF11都通过驱动p21降解来增强肿瘤细胞增殖并进入S期[99], [100]。
G2期和G2/M转换
F-box and leucine-rich 2（FBXL2）是一种属于F-box家族的E3连接酶，形成Skp1-Cullin1-F-box（SCF）复合物并调控细胞周期蛋白D的泛素化。FBXL2在有丝分裂期间特异性靶向细胞周期蛋白D2和D3进行泛素化，从而阻滞G2到M的转换[101]。钙调蛋白（Calmodulin, CaM）作为细胞周期蛋白D的已知结合伙伴，通过竞争性结合到细胞周期蛋白D的IQ基序（特别是D2的Q98和D3的Q100）而充当FBXL2的拮抗剂，从而影响细胞周期蛋白D的稳定性。FBXL2在肺癌和白血病中作为肿瘤抑制因子，通过促进细胞周期蛋白D3和D2的泛素化和降解发挥作用。FBXL2的过表达破坏了细胞周期蛋白D/CDK复合物的组装，导致细胞周期阻滞和凋亡，最终抑制致瘤性[102], [103]。尽管USP14和USP22都通过CDK1/细胞周期蛋白B复合物调控G2/M转换，但它们通过不同的分子机制运作。USP14通过去泛素化稳定CDK1和细胞周期蛋白B，促进G2到M期的转换；具体来说，它通过从CDK1上去除K48连接的多聚泛素链来促进细胞周期进程，从而防止其蛋白酶体降解[104], [105]。通过b-AP15抑制USP14已被证明通过促进p27的积累（从而减弱CDK1/细胞周期蛋白B活性）诱导G2/M细胞周期阻滞[106], [107]。相比之下，USP22在一个涉及细胞周期蛋白B/CDK1复合物的调节反馈回路中发挥作用。USP22被CDK1磷酸化，这激活了其对细胞周期蛋白B的去泛素化活性。通过这种机制，USP22促进细胞周期蛋白B的稳定并促进G2/M转换。进入有丝分裂后，USP22本身被APC/C
CDC20复合物靶向降解，确保有丝分裂的正常进程和及时的M期退出[108]。这些发现表明，细胞周期组分可以积极调节其自身的调控酶，形成自我强化的反馈回路，以确保精确和协调的细胞周期进程。USP39也通过差异调控两种功能相反的蛋白质——细胞周期蛋白B和p21——来促进G2/M转换。有趣的是，USP39根据底物和细胞环境发挥不同的调控作用。对于细胞周期蛋白B，USP39通过去除K29连接的多聚泛素链直接增强蛋白质稳定性[109]。相比之下，对p21的调控主要发生在转录后水平，而非通过翻译后修饰。USP39通过降低启动子活性来抑制p21表达，从而废除CKI对细胞周期的抑制作用[110]。总之，这些双重机制——稳定一个正向细胞周期调控因子和抑制一个负向调控因子——协同驱动异常的细胞周期进程。
M期和M/G1期转换
细胞周期蛋白A在有丝分裂后期被APC/C
CDC20复合物降解，从前期开始，在中期完成降解。细胞周期蛋白A的积累不足会阻止从中期到后期的进程，独立于通常调节后期进入的SAC[119]。最近一项研究揭示，APC/C介导的细胞周期蛋白A降解通过一个不同于其典型D框（通常作为被识别的降解子）的结构域发生[120]。OTUD7B的表达在细胞周期中波动，并与APC/C的激活保持一致。由于APC/C通过泛素化各种与Cdc20或Cdh1形成复合物的底物来影响整体细胞周期调控[111]，OTUD7B通过从关键的APC/C底物（如Aurora A、FoxM1和细胞周期蛋白B）上切割泛素链来对抗APC/C介导的泛素化，从而允许正常的有丝分裂进程[121]。两种E3连接酶，甲状腺激素受体相互作用蛋白12（TRIP12）和HECTD1，也通过调节关键细胞周期组分来协调有丝分裂进程。虽然TRIP12的mRNA水平在整个细胞周期中保持恒定，但其蛋白质表达在S期变得可检测并在G2期达到峰值，促进正常的M期进入。有趣的是，TRIP12不是通过底物的泛素化，而是通过其IDR结构域结合到常染色质来调控细胞周期，以维持基因组完整性[112]。相比之下，HECTD1调控BUB3的活性，BUB3是有丝分裂检查点复合物（Mitotic Checkpoint Complex, MCC）的核心组分，MCC控制SAC。HECTD1的耗竭导致BUB3活性降低，从而损害有丝分裂进程；值得注意的是，这种调控不改变BUB3的总蛋白水平。这些发现突出了E3连接酶的功能多样性，其作用超越了典型的蛋白质降解，包括直接调节蛋白质活性[113]。
总而言之，这些发现证明E3连接酶和DUBs可以作为竞争性调控因子，对共同底物施加相反影响，也可以作为合作伙伴协调调节底物活性。重要的是，底物的最终命运——是指向典型的蛋白酶体降解，还是功能稳定化和激活——由多种因素决定，包括特定的相互作用界面、底物上靶向的赖氨酸残基以及形成的不同类型的多聚泛素链连接。
小分子抑制剂及其应用
鉴于在调控关键细胞过程中的重要作用，UPS已成为癌症治疗中极具前景的靶点，并可能为癌症治疗提供巨大潜力[122], [123]。针对UPS机制（从蛋白酶体到E3连接酶和DUBs）设计的小分子抑制剂目前正在研究中，部分抑制剂已进入临床试验（表2）[124]。
靶向E1、E2和E3酶的小分子抑制剂
尽管UPS具有五个核心组分，通过高度协调和可逆的反应发挥功能，但大多数研究主要集中在E3连接酶和DUBs上。相比之下，靶向E1和E2酶的研究并不受限，这在很大程度上是由于药代动力学方面的挑战[125], [126]。在E1抑制剂中，PYR-41和PYZD-4409已知通过调控p53稳定性来促进癌细胞凋亡[127], [128]。最近，开发了三种靶向E1酶UBA1（编码E1酶UBE1的基因）的小分子抑制剂（TAK-243、CPL-410-005和LP0040）。其中，只有TAK-243（也称为MLN7243）已推进到I期临床试验（NCT06223542和NCT03816319）[129], [130]。已开发出小分子抑制剂（如CC0651、IJ-5和TZ9），通过与活性位点、变构位点或蛋白质相互作用位点结合来抑制E2酶的活性[131], [132], [133]。迄今为止，已报道超过20种E2结合酶抑制剂。然而，由于E2酶主要与E3连接酶密切合作发挥功能——将泛素传递给E3而非直接传递给底物——大多数小分子抑制剂要么同时靶向E2和E3酶，要么被设计为特异性抑制E3连接酶[134], [135]。因此，尽管具有相当大的治疗潜力，但靶向E2酶的药物尚未超越临床前阶段。相比之下，E3连接酶直接识别底物并催化泛素标签的附着，使其成为有吸引力的药物靶点。因此，大量努力已投入到开发E3连接酶抑制剂中，其中许多旨在阻断底物降解[136]。其中包括针对鼠双微体2同源物（mouse double minute 2 homolog, MDM2）的小分子抑制剂，MDM2是最著名的促进泛素介导的p53降解的E3连接酶，这些抑制剂正在临床试验中[137]。此外，靶向抗凋亡E3连接酶（如X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、凋亡抑制蛋白（IAPs）和SCF复合物）的抑制剂也在进行临床试验[138], [139], [140]。
小分子对DUBs的抑制
与通过泛素化促进底物降解的E3连接酶不同，DUBs通过去除泛素链来稳定蛋白质。因此，正在积极开发控制癌蛋白的DUB小分子抑制剂[141], [142]。在DUBs中，USP7是研究最广泛的，因为它在调节p53方面的双重功能：稳定MDM2同时促进MDM2介导的p53降解。已开发出几种USP7抑制剂，包括P5091、P22077和FT671。此外，已设计出靶向其他DUBs（如USP1、USP14、USP28和UCHL1）的抑制剂，可以是单靶点或多靶点化合物，其中一些正朝着临床评估方向发展[143], [144], [145]。迄今为止，只有六种DUB抑制剂进行了临床试验：VLX1570（NCT02372240），一种USP14/UCHL5抑制剂，在多发性骨髓瘤中测试；以及KSQ-4279（NCT05240898），一种USP1抑制剂，在实体瘤中评估[141]。VLX1570推进到I/II期临床试验，但因剂量限制性毒性而终止[146]。相比之下，KSQ-4279仍在I期临床试验中，与聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂（PARPi）联合测试[147], [148]。尽管取得了这些进展，但进入临床试验的DUB抑制剂数量与E3连接酶抑制剂相比仍然有限，凸显了进一步研究和优化的必要性。
然而，目前这些临床候选药物与前文讨论的细胞周期调控因子之间存在明显的转化差距。例如，虽然已知USP14/UCHL5抑制剂b-AP15可诱导细胞周期阻滞，但其精确的分子机制和直接的下游细胞周期底物仍定义不清[106], [107]。这种差异源于靶向UPS机制所固有的几个根本挑战。首先，酶家族内的结构同源性——例如USP7和USP47之间或各种cullin-RING连接酶（CRL）亚基之间的高度催化结构域相似性——使开发亚型选择性抑制剂复杂化，经常导致脱靶毒性。其次，许多核心E3连接酶，包括APC/C，依赖于大的、浅的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）表面来识别底物，与定义明确的酶活性口袋相比，这些表面难以用传统小分子抑制剂靶向。此外，E3连接酶和DUBs通常表现出多效性作用，根据细胞环境作用于多种底物，这使得预测酶抑制的特异性临床结果异常困难。为了克服这些限制——特别是选择性和靶向不可成药蛋白的问题——正在开发新的治疗方式。与其仅仅抑制催化活性，创新的策略如蛋白质水解靶向嵌合体（Proteolysis Targeting Chimeras, PROTACs）和去泛素化酶靶向嵌合体（Deubiquitinase-Targeting Chimeras, DUBTACs）旨在将特定的E3连接酶或DUB直接连接到目标蛋白（Protein of Interest, POI）。通过绕过对高选择性口袋结合抑制剂的需求，而是劫持内源性UPS机制来靶向降解或稳定特定的细胞周期驱动因子，这些方法旨在弥合我们对细胞周期动力学的基本理解与有效、精确的临床干预之间的差距。
结论
作为维持蛋白质稳态的基本生物学过程，UPS通过对关键调控蛋白的不可逆降解，确保单向性，从而充当细胞周期的关键调控因子。这种决定性控制在细胞周期阶段之间建立了不可逆的转换，并提供了可逆修饰（如磷酸化）无法达到的时间精度水平。此外，E3连接酶和DUBs之间的相互作用决定了底物是经历典型的蛋白酶体降解还是功能增强。细胞周期蛋白D的案例突显了细胞周期准确性取决于相互对立的泛素化和去泛素化活性之间的时间依赖性平衡。这种平衡的崩溃——其中一方过早地压倒另一方——导致时间控制丧失，驱使细胞走向不受控制的细胞周期进程。最终，细胞周期的功能命运取决于这种精确的、特定背景下的E3连接酶和DUBs之间的权力转换。
尽管大多数关于UPS介导的细胞周期调控的研究主要集中在肿瘤学领域，但这一调控轴的临床意义很可能远远超出肿瘤学边界，延伸到更广泛的非癌性疾病，包括神经退行性疾病和发育异常。实际上，已经在癌症以外的各种病理环境中报道了细胞周期失调。鉴于UPS作为细胞周期进程主调控因子的功能，研究UPS功能障碍与这些疾病之间的机制联系可能揭示疾病进展的关键驱动因素。因此，未来的研究必须超越肿瘤学领域，以探索这些不同的非癌性疾病模型至关重要。揭示UPS在这些环境中的不同调控网络对于推进我们对疾病生物学的理解和开发更精确的治疗策略至关重要。
鉴于其在细胞稳态中的重要作用，许多研究报道了UPS的机制，并已开发出几种小分子抑制剂，其中一些目前正在临床试验中。然而，所有FDA批准的靶向UPS组分的药物都是传统的蛋白酶体抑制剂。这一局限性源于E3连接酶和DUBs固有的复杂性，单个酶调控多种底物，对药物设计中实现底物特异性构成重大挑战。为了克服这一关键问题，PROTACs和DUBTAC技术已经出现[149], [150]。这些重要的小分子通过化学连接子将POI连接到E3连接酶或DUB募集配体，提供了一种新颖的策略来精确绕过传统药物面临的问题。这些创新的TPD方法目前正在临床前和临床开发中进行密集研究，特别是利用cereblon（CRBN）和von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶的PROTACs[151], [152]。然而，必须解决一些战略挑战和限制才能充分发挥其治疗潜力[154]。展望未来，关键策略包括：第一，显著扩展E3连接酶工具箱，超越常用的CRBN和VHL，以增强靶点特异性并克服耐药机制。第二，对于DUBTAC技术，实现高DUB特异性并形成稳定的三元复合物对于成功应用至关重要。尽管做出了这些努力，但TPD技术面临固有的药代动力学限制，主要是由于PROTAC分子相对较大，常常阻碍理想的口服生物利用度。此外，耐药性的产生（特别是通过募集的E3连接酶突变或丢失）以及保证三元复合物最佳稳定性的需要仍然是必须克服的关键障碍。
总之，研究人员全面总结了E3连接酶和DUBs在细胞周期调控中的作用，强调了泛素依赖性蛋白水解信号对于忠实细胞周期进程至关重要。此外，这些UPS组分的失调是异常细胞周期进程的已知驱动因素，损害基因组完整性并导致癌症发展。尽管大量报告表明靶向E3连接酶和DUBs是一种有效的治疗策略，但底物识别的精确机制以及可逆泛素化和去泛素化过程之间的复杂相互作用仍不清楚。因此，对这些分子复杂性的深入理解对于拓展抗癌治疗策略的格局至关重要。
