转座子帮助扩展CRISPR工具箱:又一高效正交的CAST系统 CRISPR RNA引导插入10kb DNA大片段

时间:2022年11月23日
来源:生物通

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受转座子可利用CRISPR RNA引导实现DNA转座的启发,研究人员竞相开发各种CAST系统,以扩展CRISPR工具箱,实现复杂多重的大片段DNA插入、同时避免靶点免疫和转座子再重组等问题,为细菌和其他生物体改造提供高效灵活的工具。

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原核生物中的CRISPR-Cas系统可通过RNA引导外源遗传元件(如噬菌体和质粒)降解,实现DNA编码、RNA介导、核酸靶向的适应性免疫系统。除此之外,CRISPR-Cas系统也参与了类似Tn7转座子的DNA转座(由CRISPR RNA引导)。目光敏锐的研究人员受其启发,争相尝试将其开发为一种新的基因组工程工具——CRISPR相关转座子(CAST)——这种结合了CRISPR-Cas和转座子蛋白的系统可用于对相当大的“货物DNA”进行可编程的位点特异性整合,从而避免了对DNA切割和涉及内源性修复机制的同源导向修复的需要。

目前已经鉴别出多种不同类型的CRISPR相关转座子(CAST),包括:I-F3、V-K以及I-B1和I-B2。I-F3和 I-B系统利用Cascade(用于抗病毒防御的CRISPR相关复合体,CRISPR-associated complex for antiviral defense)效应复合物,并且天然缺乏 I 型系统中通常负责DNA切割的Cas3解旋酶-核酸酶,而V-K系统利用天然缺乏核酸酶功能的Cas12k。所有三种CAST系统均结合使用CRISPR-Cas机制和转座子蛋白进行RNA引导的DNA转座,其机制与Tn7相似。I-F3型CAST Tn6677已经被简化为单质粒形式,并用于多重基因组工程,以及在混合群落背景下进行特定物种和特定位点的基因组编辑,这种基因组工程工具为大片段DNA载荷实现位点特异性整合提供了巨大前景。

尽管已经有了一些简化的系统,为实现复杂多重的基因组工程同时避免靶位点免疫和转座子再重组等问题,北卡罗来纳州立大学的研究人员在这项研究中尝试开发一个具有高效和正交的I-F3型CAST扩展基因组编辑工具。他们选择了来源于γ -变形菌的 I-F3型CRISPR相关转座子系统,分析了对转座活性至关重要的所有成分,尝试在不同的温度、不同转座子大小和不同靶点PAM序列等条件下分析它们的RNA引导的DNA整合活性,并在大肠杆菌中进行功能测试,能实现在大肠杆菌基因组上添加多达10,000个额外碱基的大片段DNA,重写而不仅仅是编辑其基因组的大片段。结果表明新的CAST系统在温度、转座子大小和灵活的PAM要求方面具有显著的集成效率。研究结果支持将这些CAST系统分类为功能兼容组,以实现有效和正交的RNA引导的DNA整合。这项工作使用新的、CRISPR RNA引导的DNA整合系统,扩展了基于CRISPR的工具箱,可应用于复杂而广泛的基因组工程工作,在治疗学、生物技术和更可持续和高效的农业需要灵活的基因组编辑时,可能对细菌和其他生物体的操纵产生重大影响。


细菌利用CRISPR-Cas作为适应性免疫系统来抵御病毒等敌人的攻击。这些系统已经被科学家应用于移除、切割和替换各种生物的特定遗传密码序列。这项新发现表明,可以移动或添加的遗传密码的数量呈指数级增加,这可能会增加CRISPR的功能。

“在自然界中,转座子选择了CRISPR系统,自私地在有机体的基因组中移动自己,以帮助自己生存。反过来,我们通过与转座子集成一个可编程的CRISPR-Cas系统,可以“移动”我们所设计的执行某些功能的“基因货物”,”“类似于将特定的行李或货物带进汽车,在汽车到达目的地时交付载荷货物,”Rodolphe Barrangou说,他是北卡罗来纳州州立大学食品、生物加工和营养科学Todd R. Klaenhammer特约教授,也是这篇论文的通信作者。Barrangou说:“使用这种方法,我们证明了我们可以通过移动多达10,000bp的DNA大片段来设计基因组。”“大自然已经做到了这一点——生物信息学数据显示,基于转座子的CRISPR系统可以移动多达10万个基因字母,现在我们可以通过使用这个系统来控制和设计它。

研究人员在体外和大肠杆菌体内都证明了这种方法的有效性。研究人员选择了10种不同的与CRISPR相关的转座子来测试该方法的有效性。这一方法适用于所有10个转座子,尽管它们的有效性因温度和转座子负载大小等因素而有所不同。

北卡罗来纳州立大学的研究生、该研究的第一作者艾弗里·罗伯茨(Avery Roberts)说:“令人兴奋的是,我们测试的所有系统在将它们从原生生物形态重建为基因组编辑工具后都能正常工作。”“我们发现了这些系统的新特性,但随着该领域的快速发展,可能会有更多相关的发现和应用出现。”

研究还表明,该方法可以同时用于不同的转座子。

Barrangou说:“不像其他CRISPR系统——如我们熟悉的II型Cas-9系统只能携带一个基因,我们可以引入整个代谢途径,将一整套新的功能整合到有机体中。”“在未来,这可能意味着为植物提供更灵活的抗病性或抗旱性。”

先正达种子公司种子研究全球主管Gusui Wu表示:“我们对这些发现感到兴奋,并看到了将这些新发现的系统应用于作物作物的潜力,以加速开发更有韧性、产量更高的品种。”

这篇论文发表在《Nucleic Acids Research》上。资金由先正达种子公司提供,先正达于2017年被中国化工集团收购。这篇论文的共同作者包括北卡罗来纳州立大学的研究生艾弗里·罗伯茨和前北卡罗来纳州立大学博士生马修·内瑟尼。


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