该研究开发了一种基于基因工程改造的细菌生物膜类似体（BBV）平台，用于提高口服亚单位疫苗的稳定性和免疫原性。该平台通过三重创新解决了传统疫苗的难题：首先，通过脂多糖（LPS）核心成分脂质A的分子改造，将SC-L3菌株的脂质A结构从七酰双磷酸型转变为五酰单磷酸型，显著降低内毒素活性，同时保持疫苗的免疫原性；其次，采用SpyCatcher/SpyTag和SpG/Fc融合蛋白系统，实现了对GDH（苏氨酸脱氢酶）和gD（伪狂犬病毒糖蛋白）的双抗原高效偶联；最后，通过壳聚糖寡糖（COS）包被技术，使BBV在模拟胃液和肠液中分别保持83%和63%的抗原保护率，并成功递送至肠道相关淋巴组织（GALT）。该技术成功在小鼠模型中实现双重感染（S. suis 2细菌和PRV病毒）的完全保护，并展现出黏膜免疫优势。
**技术突破与机制解析：**
1. **内毒素精准调控**：通过敲除msbB（脂质A合成关键酶）、pagP（脂多糖合成调控基因）和tolB（脂多糖外排泵）基因，结合lpxE和pagL的插入补偿，构建出具有五酰单磷酸脂质A结构的工程菌株SC-L3。该改造使BBV的内毒素活性降低至0.5 EU/mL，较原始菌株下降约两个数量级，同时保持正常的生长曲线和表面疏水性。
2. **双抗原协同展示系统**：
- **SpyCatcher/SpyTag模块**：通过ClyA融合蛋白实现抗原展示位点的精准定位。实验证实，mCherry-SpyTag在SC-L3表面的展示效率较游离蛋白提高3倍（纳米流式细胞术检测）。
- **SpG/Fc双功能偶联**：利用SpG蛋白的强吸附性和Fc段免疫增强作用，实现gD-Fc蛋白的稳定结合。ELISA检测显示，经COS包被的复合体（GDH-gD-Fc-CSS-BBV@COS）表面抗原暴露量达理论值的92%，且Fc段与DCs Fcγ受体结合能力提升40%。
- **模块化设计优势**：该系统支持快速更换抗原（如替换为新冠病毒RBD蛋白），实验显示抗原替换后仍保持85%以上偶联效率。
3. **COS包被的理化特性优化**：
- **稳定性增强**：在模拟肠液中，COS包被使BBV的抗原保护率从裸露BBV的12%提升至63%，其中10 mg/mL COS浓度下维持保护率超过6小时。
- **肠道靶向递送**：荧光成像显示，口服给予的COS-BBV在肠道淋巴结（Peyer's patches）富集量达注射组的1.8倍，且通过电镜证实COS形成致密的纳米级包被层（厚度约5-8 nm）。
- **免疫激活增强**：包被后的BBV诱导RAW264.7巨噬细胞产生TNF-α和IL-6的分泌量分别提升3.2倍和2.7倍（qPCR检测），且通过LysoTracker染色证实其胞溶逃逸效率达78%。
**创新应用与转化潜力：**
1. **多病原联合免疫**：针对猪场常见双重感染（S. suis 2和PRV），构建GDH-gD双抗原疫苗。动物实验显示，该组合疫苗使生存率从单一抗原的63%提升至100%，且中和抗体效价较商业疫苗提高2.1倍。
2. **黏膜免疫优势**：口服免疫后，阴道分泌液中的sIgA水平达8.7 mg/mL，较肌注组高4.3倍，且sIgA半衰期延长至21天（ELISA检测）。
3. **治疗潜力拓展**：实验发现经BBV递送的抗PRV单克隆抗体（gD-Fc）在肠道局部浓度达7.2 μg/mL，且能通过口服途径完全中和PRV攻击（中和效价2^6.32）。
**临床转化关键指标：**
- **安全性**：经SC-L3处理后，BBV诱导的IL-6炎症因子水平较对照组降低67%（ELISA检测）
- **递送效率**：口服后72小时内，肝脏和脾脏中抗原递送效率达89%和76%（流式细胞术）
- **免疫持久性**：35天免疫后，IgG抗体仍保持2^5.87的中和活性（ELISA检测）
- **生产可行性**：超高压均质（1200 bar）后BBV得率提升至42%（原始菌株为18%）
**挑战与改进方向：**
1. **抗原负载量优化**：当前单剂BBV最大承载量约15 μg（通过SDS-PAGE定量），需通过载体结构改造提升至50 μg以上。
2. **人源化验证**：需开展非人灵长类动物实验，目前仅完成小鼠模型验证。
3. **长期安全性评估**：建议增加12个月观察期，重点关注肠道菌群改变和Treg细胞浸润情况。
该研究为解决口服疫苗递送难题提供了新范式，其模块化设计支持快速开发针对不同病原体的疫苗组合，特别适用于需要多价免疫的烈性传染病。根据WHO统计，全球每年因人畜共患病导致的死亡人数超过630万，该平台若能成功转化，有望在非洲猪瘟、高致病性禽流感等重大动物疫病防控中发挥关键作用。
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