缺氧诱导VEGF分泌促进双特异性T细胞衔接器耐药性的机制研究

本研究针对双特异性T细胞衔接器（BITE）在卵巢癌治疗中的耐药难题，通过分析临床进展期患者样本发现，缺氧微环境通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）分泌和上皮-间质转化（EMT），导致靶抗原MUC16/CA125下调，进而介导BITE治疗耐药。研究证实抗VEGF治疗可逆转耐药性，为联合免疫治疗提供了新策略。

在妇科恶性肿瘤中，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）因其易复发和预后差的特点，始终是临床治疗的难点。尽管免疫检查点抑制剂（ICI）在多种肿瘤中取得突破，但在卵巢癌治疗中却收效甚微。双特异性T细胞衔接器（Bispecific T-cell Engager， BITE）作为一种新型免疫疗法，通过同时靶向肿瘤相关抗原和T细胞表面CD3分子，引导T细胞特异性杀伤肿瘤，为卵巢癌治疗带来新希望。MUC16/CA125在95%的HGSOC中高表达，使其成为理想的靶点。然而，针对MUC16的BITE疗法在临床试验中反应率有限，其耐药机制尚不明确。

为揭示耐药机制，研究团队收集了10例接受MUC16靶向BITE治疗后疾病进展的卵巢癌患者的血清、外周血单核细胞（PBMC）和腹水样本。通过对其中2例（M02、M10）腹水肿瘤细胞的深入分析，发现肿瘤细胞表面MUC16/CA125表达显著下调，并伴随上皮-间质转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition， EMT）特征。有趣的是，患者PBMC在体外实验中仍能有效裂解表达MUC16的肿瘤细胞，提示耐药主要源于肿瘤细胞自身的改变。

进一步探究发现，腹水形成的缺氧微环境是驱动上述变化的关键因素。体外实验中，缺氧（HX，1% O₂）条件可诱导卵巢癌细胞（OVCAR3、OVCAR4）下调MUC16/CA125表达（转录水平和蛋白水平），并上调EMT标志物（如Vimentin表达增加、E-cadherin表达减少），增强细胞迁移和侵袭能力。

机制上，缺氧诱导的VEGF分泌显著增加。条件培养基转移实验证实，来自缺氧细胞或患者M02细胞的培养基可显著抑制BITE介导的细胞毒性，而VEGF-A阻断抗体贝伐珠单抗（Bevacizumab）可恢复缺氧条件下BITE的杀伤效果。CRISPR/Cas9技术敲除VEGF基因同样可逆转缺氧导致的BITE耐药。

在T细胞层面，缺氧条件培养基可抑制T细胞增殖，并通过BH3分析显示，缺氧和高VEGF环境共同增强了T细胞的凋亡敏感性和对BCL-XL、BCL-2、MCL-1等促生存蛋白的依赖性。

主要关键技术方法

本研究综合利用了临床样本分析（患者腹水肿瘤细胞、配对血清和PBMC）、细胞模型（OVCAR3、OVCAR4等卵巢癌细胞系）、缺氧细胞培养模型、蛋白质印迹（Western Blot）、流式细胞术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、CRISPR/Cas9基因敲除、体外细胞毒性实验（共培养+荧光素酶检测）、细胞迁移/侵袭实验、BH3谱分析（评估线粒体凋亡 priming）以及细胞因子多重检测等技术平台。

Characterization of tumor samples from patients with progressive disease

对进展期患者肿瘤样本的分析显示，腹水来源的肿瘤细胞（M02, M10）丢失了MUC16/CA125表达，并表现出EMT相关蛋白（N-cadherin, Vimentin, Snail）的表达，提示抗原丢失和EMT是潜在的耐药机制。

Characterization of peripheral blood mononuclear cells from patients with progressive disease

尽管患者PBMC中存在活化和耗竭T细胞亚群，但来自进展期患者的PBMC在体外仍能有效介导BITE依赖的肿瘤细胞裂解，表明效应T细胞功能并非耐药主因。

Patient serum cytokine profiling and effect on ex vivo cytotoxicity

患者进展期血清中炎症因子（IL18, IFN-α, IL8等）和免疫抑制因子（IL4, IL5, IL10）水平升高，且患者血清可抑制体外BITE cytotoxicity，提示血清中存在抑制性因子。

Effect of hypoxia on CA125 expression and EMT phenotype

缺氧可时间依赖性地下调卵巢癌细胞MUC16/CA125的表达（mRNA和蛋白），诱导EMT表型，并增强细胞迁移和侵袭。CRISPR敲低MUC16亦可诱导EMT并增强迁移。

Stabilization of MUC16/CA125 expression in hypoxic-conditioned cells

缺氧导致的CA125下调在恢复常氧后可逆。蛋白酶体抑制剂MG132可部分恢复缺氧下的CA125表达，但未能有效恢复BITE cytotoxicity，表明单纯恢复抗原表达不足以保证疗效。

Effect of hypoxia-induced VEGF on MUC16-BITE efficacy

缺氧显著促进卵巢癌细胞和患者来源细胞（M02, M10）分泌VEGF。条件培养基实验证明缺氧培养基或患者M02培养基中的可溶性因子可抑制BITE cytotoxicity。VEGF阻断抗体贝伐珠单抗可特异性恢复缺氧条件下BITE的疗效。

T-cell suppression by VEGF and hypoxia

缺氧条件培养基抑制T细胞增殖。BH3分析显示，缺氧和高VEGF环境共同作用，显著增强了T细胞的线粒体凋亡priming和对促生存蛋白（BCL-XL, BCL-2, MCL-1）的依赖性，导致T细胞更易凋亡。

结论与讨论

本研究系统阐明了缺氧肿瘤微环境诱导卵巢癌对MUC16靶向BITE产生耐药的协同机制：缺氧不仅直接下调靶抗原MUC16/CA125的表达并诱导EMT，还促进VEGF大量分泌。VEGF不仅能直接抑制T细胞功能、增强其凋亡敏感性，还能在抗原表达正常的情况下削弱BITE的疗效。这揭示了肿瘤微环境通过多环节共同作用导致免疫治疗耐药的新范式。研究结果具有重要的临床转化价值，一方面提示监测肿瘤缺氧状态和VEGF水平可能作为预测BITE疗效的生物标志物；另一方面，强有力地支持了将BITE与抗VEGF药物（如贝伐珠单抗）联合使用的治疗策略，为克服卵巢癌等实体瘤的BITE耐药提供了直接的理论和实验依据。本研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，为改善难治性卵巢癌的免疫治疗效果开辟了新的途径。