DR5 CAR-T细胞能够靶向黑色素瘤并抑制髓源性抑制细胞（MDSCs），同时具有极低的毒性

死亡受体5（DR5）靶向的CAR-T细胞通过直接杀伤肿瘤细胞和抑制髓系源性抑制细胞（MDSCs）改善实体瘤治疗，在多个动物模型中显示抗肿瘤活性且安全性良好。

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宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院病理学与实验室医学系，美国宾夕法尼亚州费城19104

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在实体瘤中的疗效较差，这是由于目标特异性有限以及肿瘤微环境具有免疫抑制作用。我们基于死亡受体5（DR5）在实体瘤和髓源性抑制细胞（MDSCs）中的高表达水平，将其作为CAR靶点进行了研究。我们构建了针对DR5的激动型CAR结构，并在多种模型中评估了其活性，证实了DR5表达依赖性的肿瘤杀伤作用，这一结果通过基因敲除和过表达实验得到了验证。当DR5靶向单链可变片段在非效应细胞或细胞外囊泡上表达时，仍保持其促凋亡活性。在多种CAR设计中，我们发现了一种具有优化结合亲和力的结构，既能维持T细胞活力，又能保持对肿瘤和MDSCs的强大杀伤能力。为了评估其在免疫功能正常情况下的安全性和有效性，我们还开发了一种小鼠DR5靶向CAR。在多种异种移植和同基因小鼠模型中，DR5 CAR-T细胞减少了肿瘤生长，延长了生存期，并未引起可检测到的毒性。在患者来源的类器官和组织切片中，DR5 CAR-T细胞浸润肿瘤组织，减少了MDSCs的数量，增强了CD8⁺ T细胞的活性，并抑制了肿瘤生长。这些发现表明，DR5靶向CAR-T疗法是一种有前景的治疗实体瘤的策略，它结合了直接的肿瘤细胞毒性和免疫激活作用，同时将脱靶效应降至最低。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在实体瘤中效果仍然有限。部分原因是缺乏肿瘤特异性抗原以及肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用。

TME包含多种抑制免疫活性的细胞类型，如髓源性抑制细胞（MDSCs）、癌相关成纤维细胞和肿瘤相关巨噬细胞。这些细胞以及密集的细胞外基质成分限制了CAR-T细胞的浸润，并导致T细胞耗竭，从而降低了细胞毒性疗效。针对TME中的抑制性成分，特别是MDSCs，是一种改善CAR-T细胞在实体瘤中功能的新兴策略。

死亡受体5（DR5，也称为TNFRSF10B、TRAIL-R2或CD262）是一种跨膜受体，在凋亡信号传导中起关键作用。它在许多实体瘤中表达上调，包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和结肠癌，并且也在MDSCs上表达。TRAIL配体或激动型抗体的激活会启动一个复杂的信号级联反应，涉及FADD、caspase-8、BID和caspase-3等下游效应因子。这种选择性表达模式使DR5成为了一个有吸引力的治疗靶点。尽管已有几种DR5激动型抗体在临床试验中进行了测试并显示出减少MDSCs的效果，但它们的整体抗肿瘤疗效仍然有限。

在本研究中，我们构建了四种针对DR5的CAR结构，并在2D和3D肿瘤模型中评估了它们的细胞毒性。当DR5靶向单链可变片段（scFvs）在非效应细胞上表达或通过细胞外囊泡（EVs）传递时，仍保持其促凋亡活性。通过亲和力测量和功能筛选，我们选择了一种既能保持高亲和力和疗效又能最小化T细胞相互杀伤的CAR结构。为了评估其在免疫功能正常情况下的安全性和有效性，我们还生成了一种小鼠DR5 CAR。DR5 CAR-T细胞在异种移植和同基因模型中表现出抗肿瘤活性，且未出现脱靶毒性。在患者来源的肿瘤模型中，这些细胞浸润肿瘤组织，减少了MDSCs的数量，激活了肿瘤驻留的CD8⁺ T细胞，并抑制了肿瘤生长。这些结果共同支持DR5靶向CAR-T细胞作为一种有前景的双功能免疫疗法，能够诱导直接的肿瘤细胞死亡，同时重塑肿瘤免疫环境。

DR5 CAR-T细胞对DR5⁺肿瘤细胞具有高度细胞毒性

为了评估组织中DR5的表达情况，对临床黑色素瘤组织进行了原位杂交和免疫组化（IHC）分析，发现大多数黑色素瘤患者样本中DR5的mRNA和蛋白质水平均显著升高（图S1A），而正常组织（如心脏、肺、肾脏、肝脏、肾上腺和大脑）中的DR5蛋白表达较低（图S1B）。四种人源DR5-scFvs的蛋白质序列被逆转录成DNA

讨论

CAR-T细胞疗法在实体瘤中面临主要障碍，尤其是由于肿瘤微环境的免疫抑制作用和缺乏肿瘤特异性抗原。在本研究中，我们展示了所选的DR5靶向CAR-T细胞可能通过两种机制克服这些限制：直接杀伤表达DR5的肿瘤细胞并消除免疫抑制性的MDSCs。这些CAR-T细胞在体外和体内实验中均表现出显著的抗肿瘤活性，包括多种异种移植和同基因小鼠模型

人源DR5 CAR载体构建

我们从国际免疫遗传信息系统（mAB-DB ID 183、224、234和348）获得了四种抗人DR5抗体序列。人源化DR5 scFvs的氨基酸序列被转化为cDNA，并由Integrated DNA Technologies公司定制合成。重链（VH）和轻链（VL）的可变域DNA片段通过-(G4S)3连接子连接，并两侧加上人CD8 leader序列。这些cDNA随后被克隆到一个工程化的pTRPE CAR载体中

数据和代码的可用性

评估论文结论所需的所有数据均包含在论文和/或补充材料中。DNA构建物可在完成科学审查和材料转让协议后由宾夕法尼亚大学董事会提供。

致谢

作者感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Penn Cytomics和Cell Sorting共享资源实验室，特别是田世夫（Shifu Tian），感谢他提供了CAR-T细胞纯化的方案。感谢宾夕法尼亚大学佩尔曼医学院细胞免疫治疗中心的John Scholler提供了质粒和构建信息。感谢MD安德森癌症中心的功能蛋白质组学RPPA核心团队进行了相关实验

作者贡献

X.X.和H.W.构思了该项目并设计了研究方案。X.X.、H.W.、G.K.、R.A.、L.S.和S.L.收集并分析了样本。H.W.、S.L.、P.S.、X.Z.、Q.Z.、H.M.、J.Y.、Y.G.、L.H.和F.L.进行了实验操作。H.W.、S.L.和P.S.制备了DR5 CAR-T细胞。F.L.进行了生物信息学分析。B.G.进行了抗体计算分析。Y.G.设计了图形摘要。H.W.、F.L.、F.M.、C.Z.、M.M.、Y.F.和C.J.参与了CAR-T细胞的开发。

利益声明

H.W.、S.L.和X.X.是涉及DR5-CAR-T细胞疗法方法的专利申请的发明人（临时专利），代表宾夕法尼亚大学。X.X.报告了来自Incytes的资助支持，以及CureBiotech、Exio Bioscience、TLR Biosciences和Evinacel Therapeutics的创始股东身份和董事会成员资格。C.H.J.报告了诺华公司支付的版税，以及来自Kite Gilead的资助支持和个人费用，以及创始股东身份