纳米疫苗研究新突破:对抗洋葱伯克霍尔德菌感染的新希望
埃及米斯尔科技大学药学院微生物学与免疫学系的 Wesam E. Gawad 等研究人员在npj Vaccines期刊上发表了题为 “Cyclic di AMP phosphodiesterase nanovaccine elicits protective immunity against Burkholderia cenocepacia infection in mice” 的论文。该研究通过反向疫苗学筛选洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)潜在疫苗候选物,并制备成纳米疫苗进行研究,为预防和控制该菌感染提供了新的策略和方向,有望拯救免疫功能低下患者的生命,在疫苗研发领域具有重要意义。
一、研究背景
洋葱伯克霍尔德菌复合体(Burkholderia cepacia complex,Bcc)是一组革兰氏阴性、机会性 β - 变形杆菌,包含至少 24 种遗传上不同的物种。其中,洋葱伯克霍尔德菌感染对免疫功能低下患者,尤其是囊性纤维化(CF)和慢性肉芽肿病(CGD)患者,具有生命威胁。该菌感染还可引发致命的坏死性肺炎 —— 洋葱伯克霍尔德菌综合征,常导致患者因败血症过早死亡。
洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药物表现出异质性耐药,其耐药机制包括外排泵过表达、药物靶点突变、细胞通透性降低、酶失活、限制性孔蛋白、外膜通透性屏障、药物靶点改变或抗生素修饰等,且能形成生物膜增强耐药性。目前,由于其多种毒力因子以及对多种抗菌剂的固有和获得性耐药,临床上缺乏有效的治疗方法来根除洋葱伯克霍尔德菌感染,因此开发新的预防策略迫在眉睫。
预防性疫苗接种是保护易感人群、限制感染传播和抗生素耐药性的有效方法。鉴于洋葱伯克霍尔德菌是一种呼吸道病原体,能在细胞内生存,开发能产生黏膜分泌型 IgA 反应的疫苗是预防细菌定植的有效途径。同时,在疫苗设计中需考虑 Th1(细胞免疫反应)和 Th2(体液免疫反应)的平衡,Th17 细胞也在增强抗菌黏膜防御和介导保护性疫苗诱导反应中发挥重要作用。
传统的全细胞疫苗(灭活或减毒)存在诸多缺点,如不必要的抗原负荷导致非特异性免疫反应、培养困难、耗时、产品不准确且不稳定、减毒不足、成本高、免疫原性低和抗原过敏等。近年来,反向疫苗学(Reverse Vaccinology,RV)借助全细菌基因组序列和各种计算机工具,通过计算机辅助方法识别和筛选潜在疫苗候选物,克服了全细胞疫苗的许多局限性,已成功应用于多种病原体的疫苗研发。
二、研究材料与方法
(一)细菌菌株和生长条件
研究使用洋葱伯克霍尔德菌 J2315(DSM# 16553),在 30°C 的 LB 肉汤和琼脂中培养 48h。克隆宿主大肠杆菌 TOP 10 和表达宿主大肠杆菌 BL21(DE3 菌株)在 37°C 的 LB 肉汤和琼脂中培养 18 - 24h,必要时添加氨苄青霉素(100μg/mL)。细菌菌株保存在含 20% 甘油的 LB 肉汤中,于 - 80°C 储存。
(二)生物信息学分析
从 UniProt 数据库获取洋葱伯克霍尔德菌 J2315 的蛋白质组,用 PSORTb 预测蛋白质亚细胞定位。通过 Vaxign 数据库筛选细胞外和外膜蛋白,排除与宿主(人和小鼠)蛋白质具有序列同源性的蛋白,并预测其黏附细胞的能力。利用 Expasy Protparam 服务器根据物理化学参数(分子量和不稳定性指数)筛选蛋白,不稳定性指数截断值设为 < 40。使用 VaxiJen2.0 服务器预测潜在抗原性,阈值设为≥0.5。通过 TMHMM v2.0 和 HMMTOP 2.0 服务器预测蛋白质拓扑结构,筛选跨膜螺旋数≤1 的蛋白。利用 IgPred 模块预测特定(IgG 和 IgA)B 细胞表位,将含 IgG 和 IgA B 细胞表位的短名单蛋白上传至 TepiTool 服务器预测 T 细胞表位。通过 BLASTp 搜索检查候选蛋白在常见 Bcc 物种中的保守性,百分比同一性和最小查询覆盖率设为 80%。
(三)同源建模
使用 SWISS MODEL 在线服务器为三个短名单蛋白构建同源模型,并用 Chimera 可视化,突出每个蛋白中 IgG 和 IgA 的表位表面抗原。
(四)候选蛋白的克隆、表达和纯化
选取三个蛋白候选物,提取洋葱伯克霍尔德菌 J2315 的基因组 DNA,设计引物进行 PCR 扩增,纯化 PCR 产物后用相应限制性内切酶双酶切,连接到表达载体 pET22b (+),转化大肠杆菌 TOP10,筛选阳性克隆。提取重组质粒转化大肠杆菌 BL21,诱导蛋白表达,用 Ni - NTA 自旋柱纯化 6x - His 标记的蛋白,通过 SDS - PAGE 评估纯度,透析后用 Bradford 法测定蛋白浓度。
(五)重组蛋白负载到壳聚糖 - 果胶纳米颗粒上
采用离子凝胶法制备壳聚糖 - 果胶纳米颗粒(CS:P NPs),将重组蛋白滴加到果胶溶液中,再滴加壳聚糖溶液,离心、洗涤、冻干。以 CS:P - BSA 作为非特异性抗原对照,用透射电子显微镜观察纳米颗粒形态,用 Malvern Zetasizer 分析仪测定粒径和 zeta 电位,用 Bradford 蛋白测定法确定负载蛋白量。
(六)小鼠免疫实验
选用 6 - 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠,适应环境一周。将小鼠分为五组,每组 14 只。前三组分别皮下注射 100μg 负载重组蛋白的 CS:P NPs 作为初免剂量,第四组注射 100μg CS:P NPs,第五组注射无菌无内毒素 PBS。初免后第 14 天和第 28 天,所有小鼠经鼻内给予相同抗原的加强剂量(50μg/20 - µL PBS)。
(七)检测指标及方法
- 验证洋葱伯克霍尔德菌在小鼠肺部的定植:部分小鼠鼻内感染约CFUs 的洋葱伯克霍尔德菌 J2315,5 天后评估肺部细菌负荷,对肺组织进行组织学检查。
- 测定血清 IgG 和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的 IgA:初免后第 42 天,收集小鼠 BAL 液和血液,用间接 ELISA 测定血清 IgG 和 BAL IgA 水平。
- 脾细胞培养和细胞因子表达分析:初免后第 42 天,取免疫和对照组小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,培养后加入重组蛋白负载的 CS:P NPs 等,72h 后用 ELISA 试剂盒测定 IL - 17A、IL - 6 和 TNF - α 浓度。
- 检测疫苗小鼠血清抗体的杀菌活性:将疫苗小鼠、佐剂组和未免疫小鼠的血清与洋葱伯克霍尔德菌 J2315 培养物孵育,48h 后通过活菌计数评估血清抗体的杀菌活性。
- 肺部清除挑战实验:初免后第 49 天,剩余小鼠鼻内感染约CFU 洋葱伯克霍尔德菌 J2315,5 天后评估肺部细菌负荷。
(八)统计分析
使用 Graph Pad Prism v9 软件进行统计分析,细胞因子表达、血清抗体杀菌活性和肺部清除实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)和 Dunnett 多重比较检验,抗体(IgG 和 IgA)滴度差异采用非配对 t 检验,
为差异有统计学意义。
三、研究结果
(一)洋葱伯克霍尔德菌 J2315 潜在疫苗候选物的鉴定
从 UniProtKB 数据库检索到 6993 个洋葱伯克霍尔德菌 J2315 的蛋白质序列,经 PSORTb 分析其蛋白质组的亚细胞定位。通过一系列严格筛选,最终确定了三个潜在疫苗候选蛋白:WP_006481710.1(LY)、WP_012493605.1(KT)和 WP_006492970.1(BD)。同源建模显示这三个蛋白具有可与抗体结合的表面暴露表位。
(二)6x - His - LY、6x - His - KT 和 6x - His - BD 蛋白的成功克隆和表达
PCR 扩增编码 LY、KT 和 BD 蛋白的 DNA 片段,成功克隆到 pET22b (+) 载体,转化大肠杆菌 BL21 后,用 Ni - NTA 柱纯化得到预期大小的 6x - His 标记蛋白,SDS - PAGE 结果显示蛋白纯化成功。
(三)重组蛋白负载壳聚糖 - 果胶纳米颗粒的表征
制备的 CS:P NPs 负载 LY、KT 和 BD 蛋白的效率分别为 71.5%、78% 和 84%。TEM 显示纳米颗粒呈球形,粒径均小于 300nm,适合鼻内给药。不同纳米颗粒的粒径、多分散指数和 zeta 电位各异。
(四)BALB/c 小鼠经鼻内感染洋葱伯克霍尔德菌后成功引发肺部炎症
感染 5 天后,从感染小鼠肺部回收到
的洋葱伯克霍尔德菌,组织学检查显示感染小鼠肺部出现严重细支气管炎、间质肺炎和血管充血,表明成功建立肺部感染模型。
(五)重组蛋白负载壳聚糖 - 果胶纳米颗粒引发 BALB/c 小鼠的全身和黏膜免疫反应
免疫小鼠的血清 IgG 滴度显著高于 CS:P NPs 组,其中 6x - His - KT 和 6x - His - LY 免疫小鼠的 IgG 反应最高。免疫小鼠 BAL 中的 IgA 滴度也显著高于 CS:P NPs 组,6x - His - KT 免疫小鼠的 IgA 反应最高。
(六)重组蛋白负载壳聚糖 - 果胶纳米颗粒诱导 BALB/c 小鼠的细胞免疫反应
免疫小鼠脾细胞培养上清液中 IL - 6 和 IL - 17A 水平显著高于对照组,6x - His - LY - CS:P NPs 和 6x - His - KT - CS:P NPs 组的 TNF - α 水平也显著升高,6x - His - KT - CS:P NPs 诱导的 IL - 17A 和 TNF - α 水平最高,6x - His - LY - CS:P NPs 诱导的 IL - 6 水平最高。
(七)免疫小鼠血清对洋葱伯克霍尔德菌具有杀菌活性
免疫小鼠血清能显著降低洋葱伯克霍尔德菌的菌落数量,与未免疫小鼠血清和 CS:P NPs 组相比,差异有统计学意义。
(八)免疫小鼠在鼻内感染洋葱伯克霍尔德菌后肺部清除能力增强
免疫小鼠肺部的细菌负荷显著低于 CS:P NPs 组和 PBS 组,6x - His - LY - CS:P NPs、6x - His - KT - CS:P NPs 和 6x - His - BD - CS:P NPs 免疫小鼠肺部的洋葱伯克霍尔德菌数量均显著降低。
四、研究结论与讨论
本研究利用反向疫苗学方法,结合生物信息学和免疫信息学工具,成功筛选出洋葱伯克霍尔德菌的潜在疫苗候选蛋白,并制备成负载重组蛋白的壳聚糖 - 果胶纳米颗粒疫苗。该疫苗通过皮下初免和鼻内加强免疫,在 BALB/c 小鼠中引发了全身、黏膜和细胞免疫反应,有效保护小鼠免受洋葱伯克霍尔德菌的肺部感染。其中,6x - His - KT - CS:P NPs 诱导的免疫反应最强,在抗体产生和细胞因子分泌方面表现突出,可能是清除感染肺部洋葱伯克霍尔德菌的关键因素。
研究中采用的反向疫苗学策略,基于严格的筛选标准,如蛋白的亚细胞定位、与宿主蛋白的非同源性、黏附概率、化学稳定性、抗原性、跨膜螺旋数以及在不同 Bcc 物种中的保守性等,确保筛选出的疫苗候选物具有较高的安全性和有效性,节省了传统疫苗筛选的时间和成本。同时,壳聚糖 - 果胶纳米颗粒作为疫苗递送系统,具有良好的免疫佐剂特性和黏膜黏附性,有助于提高疫苗的免疫原性。
然而,本研究也存在一定的局限性。目前的研究仅在小鼠模型中进行,未来需要进一步研究该疫苗对临床洋葱伯克霍尔德菌分离株及其他 Bcc 成员的有效性,以及对 CF 小鼠感染模型的保护作用,以评估其在临床应用中的潜力。尽管如此,本研究为洋葱伯克霍尔德菌感染的预防和控制提供了新的思路和实验依据,有望为免疫功能低下患者,尤其是 CF 和 CGD 患者,带来新的治疗希望,在疫苗研发领域迈出了重要的一步,为后续相关研究奠定了坚实基础。