窥探细胞内的分子运输的新工具

时间：2025年2月11日

来源：Nature Protocols

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该方案提出了一种基于荧光相关光谱的方法来跟踪荧光分子在活细胞中的扩散路线。

对相关显微镜是一种独特的荧光相关光谱技术，能够追踪活细胞中一群荧光分子相对于细胞内结构的长程扩散路径。该方法基于使用一对相关函数（pCF），通过在显微镜数据采集过程中对整个荧光强度波动进行时空比较，能够将分子到达时间的变化在空间上进行映射并进行统计量化。

细胞内的分子运输是生命活动的核心过程之一，它涉及到营养物质、信号分子和代谢产物的分配与调控。然而，由于细胞内部结构复杂且动态变化，传统的显微镜技术难以精确追踪分子的长程扩散路径。近期，第一作者单位的研究人员在国际知名期刊《Nature Protocols》上发表了一篇题为“Pair correlation microscopy of intracellular molecular transport”的论文，介绍了一种名为成对相关显微镜（Pair Correlation Microscopy, PCM）的创新技术。该技术能够实时追踪活细胞中荧光分子的长程扩散路径，并分析其与细胞内结构的相互作用。这一成果为细胞生物学和分子医学研究提供了新的工具，也为理解细胞内分子运输机制带来了新的视角。

成对相关显微镜是一种基于荧光相关光谱学（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）的独特方法，能够追踪活细胞中荧光分子群体的长程扩散路径，并将其与细胞内结构相关联。该方法通过成对相关函数（Pair Correlation Function, pCF）对显微镜数据采集过程中记录的荧光强度波动进行时空比较，从而能够对分子到达时间的变化进行空间定位和统计量化。本协议详细介绍了如何在共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM）上获取和分析线扫描成对相关显微镜数据，使用户能够提取荧光分子在活细胞内的运输模式，并量化分子在细胞内遇到的障碍物的可及性或控制分子运输事件的扩散模式。此外，该协议还展示了如何将该技术扩展到双通道线扫描采集，通过交叉成对相关函数计算，能够选择性地追踪荧光分子与光谱不同的荧光配体形成复合物后的运输模式。对于熟练的CLSM用户，该协议描述的线扫描数据采集和分析大约需要1-2天，具体取决于样本和实验数量。

细胞内的分子运输是一个复杂的过程，涉及多种生物分子的动态相互作用。传统的荧光相关光谱学（FCS）技术虽然能够提供分子扩散的动力学信息，但通常局限于小范围的局部扩散，难以追踪分子在细胞内的长程运输路径。此外，细胞内的复杂结构（如细胞器和细胞骨架）对分子运输产生显著影响，但传统方法难以定量分析这些结构对分子扩散的影响。因此，开发一种能够实时追踪分子长程运输并分析其与细胞内结构相互作用的技术，对于深入理解细胞内分子运输机制具有重要意义。

研究人员开发了一种基于成对相关函数（pCF）的成对相关显微镜（PCM）技术，用于追踪活细胞中荧光分子的长程扩散路径。该技术的核心在于通过显微镜数据采集过程中记录的荧光强度波动，利用pCF对分子到达时间的变化进行时空定位和统计量化。具体步骤如下：

样本准备：研究人员选择合适的细胞类型，并在细胞内表达或导入荧光标记的分子，以追踪其运输过程。
成像设备：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行线扫描成像，获取细胞内荧光分子的动态变化数据。
数据采集：通过CLSM的线扫描模式，记录细胞内荧光分子的荧光强度波动。
数据分析：利用成对相关函数（pCF）对采集到的荧光强度波动数据进行分析，提取分子的运输模式，并量化细胞内障碍物对分子扩散的影响。
双通道扩展：通过双通道线扫描采集和交叉成对相关函数计算，研究人员能够选择性地追踪荧光分子与光谱不同的荧光配体形成复合物后的运输模式。

成对相关显微镜（PCM）技术，可用于实时追踪活细胞中荧光分子的长程扩散路径，并分析其与细胞内结构的相互作用。PCM技术不仅能够提供分子运输的动态信息，还能够定量分析细胞内障碍物对分子扩散的影响。此外，通过双通道线扫描采集和交叉成对相关函数计算，PCM技术还能够选择性地追踪荧光分子与光谱不同的荧光配体形成复合物后的运输模式。这一成果为细胞生物学和分子医学研究提供了新的工具，也为理解细胞内分子运输机制带来了新的视角。