在全球范围内，癌症如同笼罩在人类健康上空的阴霾，其中结直肠癌（CRC）的发病率正逐年攀升，已然成为全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大主因。对于那些初诊时就发生转移的患者，以及多线化疗失败后面对预后极差局面的患者而言，治疗手段极为有限。传统一线药物和酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在晚期难治性 CRC 患者中，由于缺乏可用靶点，无法精准治疗。同时，氟尿嘧啶类药物的反复使用还会引发内在和获得性耐药，多种化疗药物与靶向疗法的盲目联合，又会增加不良反应的发生几率 。
为了打破这一困境，广西医科大学附属肿瘤医院和广西结直肠癌临床研究中心的研究人员开展了深入研究，论文发表在《Cell Death and Disease》。他们发现三氟尿苷 /tipiracil（FTD/TPI）能够通过激活铁死亡来抑制肿瘤细胞生长，并且与柳氮磺胺吡啶（SAS）联合使用时，能显著增强对 CRC 细胞的杀伤效果。这一研究成果为晚期 CRC 患者和耐药患者提供了新的临床治疗策略。
研究人员采用了多种关键技术方法。细胞实验中，使用多种细胞系进行培养；通过转录组学和蛋白质组学测序，分析 FTD/TPI 处理后细胞的基因和蛋白质变化；运用 CRISPR/Cas9 技术构建 TP53 基因敲除细胞系；在动物实验方面，利用患者来源的类器官进行培养，并建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型；还通过免疫组化、透射电镜等技术检测相关指标。此外，研究使用的人体组织样本均来自广西医科大学附属肿瘤医院，患者术前未接受化疗或放疗，并签署了知情同意书。
FTD/TPI 抑制 CRC 细胞系的活力和增殖
研究人员发现，FTD/TPI 能以时间 - 剂量梯度的方式降低四种 CRC 细胞系的活力。在 24 - 48 小时内，RKO、DLD1 和 HCT116 细胞对 FTD/TPI 较为敏感，而 HT29 细胞早期敏感性较低，需 72 小时处理才有明显效果。克隆形成实验表明 FTD/TPI 可抑制 CRC 细胞系的集落生长，EDU 荧光染色显示高浓度 FTD/TPI 能抑制 RKO 和 HT29 细胞的增殖，且细胞迁移能力也随 FTD/TPI 浓度和时间增加而减弱。转录组学和蛋白质组学测序结果揭示，FTD/TPI 处理后 RKO 细胞的相关基因和蛋白质发生了显著变化，涉及多个细胞死亡途径，尤其影响了铁死亡调节途径，其中转录因子 p53 上调，SLC7A11 基因下调。
FTD/TPI 诱导 CRC 细胞死亡
研究人员用铁死亡抑制剂（ferrostatin - 1）、坏死抑制剂（necrosulfonamide）、自噬抑制剂（bafilomycin A1）和细胞凋亡抑制剂（Z - VAD - FMK）与 FTD/TPI 联合处理 CRC 细胞。结果显示，ferrostatin - 1 能显著挽救 FTD/TPI 诱导的细胞死亡，而坏死抑制剂挽救效果不明显。FTD/TPI 与铁死亡激活剂 erastin 联合使用时，可显著抑制所有四种 CRC 细胞系的活力，EDU 荧光染色表明联合 erastin 进一步抑制细胞增殖，联合 ferrostatin - 1 则恢复细胞增殖。
在铁死亡相关功能实验中，FTD/TPI 处理使四种 CRC 细胞系内铁离子沉积增加，ROS 和脂质过氧化积累，谷胱甘肽（GSH）减少。FTD/TPI 与 erastin 联合增强了铁死亡程度，而与 ferrostatin - 1 联合则降低了脂质过氧化积累。透射电镜观察发现，FTD/TPI 处理后的 RKO 和 HCT116 细胞线粒体出现不同程度的收缩，线粒体体积减小，膜密度增加，膜内电子密度高，嵴扩张，这些都表明 FTD/TPI 可通过铁死亡途径诱导 CRC 细胞死亡。
FTD/TPI 通过 p53 - SLC7A11 轴诱导 CRC 铁死亡
转录组测序结果显示 SLC7A11 参与了 FTD/TPI 处理过程。实验证实，FTD/TPI 可抑制 CRC 细胞系中 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白质表达，ferrostatin - 1 可逆转这种抑制作用，FTD/TPI 与 erastin 联合使用则进一步降低 SLC7A11 蛋白水平。
研究还发现，FTD/TPI 处理后，四种 CRC 细胞系中内源性 p53 的 mRNA 和蛋白质表达显著增加。由于 SLC7A11 是 p53 激活铁死亡的靶基因，研究人员推测 SLC7A11 是 FTD/TPI 激活 p53 介导铁死亡的下游靶标。实验表明，FTD/TPI 处理后，SLC7A11 和 GPX4 的蛋白质表达显著降低，且 FTD/TPI 以剂量和时间依赖的方式促进 p53 蛋白表达，抑制 SLC7A11 表达。利用 CRISPR/Cas9 技术敲除 DLD1 细胞中的 TP53 基因后，FTD/TPI 处理的野生型细胞中 SLC7A11 蛋白表达梯度下降，而敲除细胞中 SLC7A11 蛋白表达有所恢复，同时敲除细胞中 ROS 和脂质过氧化积累水平降低，这充分证明 FTD/TPI 通过 p53 - SLC7A11 轴诱导 CRC 铁死亡。
FTD/TPI 直接结合 p53 并促进 MDM2 泛素化和降解来增强 p53 蛋白稳定性
为探究 FTD/TPI 对 p53 蛋白的影响，研究人员用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白质翻译，发现 FTD/TPI 可延长 p53 蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂 MG132 能增强 FTD/TPI 诱导的 p53 蛋白积累，表明 p53 水平增加可能是由于降解减少。
MDM2 是负调节 p53 的 E3 泛素连接酶，FTD/TPI 处理使四种 CRC 细胞系中 MDM2 表达呈时间和剂量依赖性下降。泛素化实验表明，FTD/TPI 显著增加了内源性和外源性 MDM2 的泛素化。细胞热迁移实验（CETSA）和分子对接结果显示，FTD/TPI 能与 p53 蛋白稳定结合，FTD/TPI 的主要成分 FTD 与 p53 蛋白通过氢键和强静电相互作用结合，占据 p53 蛋白结构的疏水口袋，结合能为 - 6.08 kcal/mol，预测的结合位点包括 Ser99、Ile254 等多个氨基酸。这些结果表明，FTD/TPI 通过直接结合 p53 并促进 MDM2 的泛素化和降解，增加 p53 蛋白稳定性，进而降低 SLC7A11 和 GPX4 蛋白表达，激活铁死亡。
SAS 增强 FTD/TPI 对 CRC 细胞的抑制作用
研究人员选取三种临床铁死亡激活剂（SAS、青蒿素（ART）和双氢青蒿素（DHC））与 FTD/TPI 联合处理敏感细胞系 RKO 和不敏感细胞系 HT29。MTT 实验表明，只有 SAS 与 FTD/TPI 联合处理能显著增加 RKO 和 HT29 细胞的死亡，且使 HT29、HCT116 和 DLD1 细胞对 FTD/TPI 更敏感。
研究发现，SAS 与 FTD/TPI 联合可进一步抑制 SLC7A11 和 GPX4 的表达，促进细胞内 ROS 和脂质过氧化积累，而 ART 和 DHC 无此作用。这表明 SAS 可能通过靶向 SLC7A11，协同增强 FTD/TPI 对 CRC 细胞的杀伤效果，为晚期 CRC 患者的治疗提供了新途径。
FTD/TPI 抑制 CRC 类器官的活力和增殖
研究人员用 FTD/TPI 处理 12 例 CRC 患者来源的肿瘤类器官，发现处理 7 或 14 天后，类器官活力受到不同程度的抑制，且呈剂量依赖性。HE 染色显示，随着 FTD/TPI 剂量增加，类器官形态逐渐减小，细胞簇和细胞核减少。Ki67 免疫组化染色表明，类器官中 Ki67 阳性细胞比例随 FTD/TPI 浓度增加而降低，说明细胞增殖受到抑制。
对敏感类器官检测发现，FTD/TPI 处理后 ROS 和脂质过氧化荧光显著积累。添加 erastin 进一步破坏类器官形态，而添加 ferrostatin - 1 则可挽救。Western blot 和免疫组化染色显示，FTD/TPI 增加了 CRC 类器官细胞中 p53 蛋白水平，降低了 SLC7A11 水平。添加 SAS 显著抑制了 9 例患者来源类器官的活力，联合培养使类器官细胞簇尺寸减小，细胞核聚集，且进一步降低了 SLC7A11 蛋白表达。这些结果表明，FTD/TPI 通过 p53 - SLC7A11 轴激活 CRC 类器官中的铁死亡，SLC7A11 可能是 SAS 增强 FTD/TPI 对 CRC 类器官致死作用的靶点。
FTD/TPI 和 SAS 联合治疗在 PDX 模型中的抑制作用
为验证 FTD/TPI 与 SAS 联合治疗在体内的疗效，研究人员建立了 PDX 小鼠模型，用 FTD/TPI 或 SAS 处理荷瘤小鼠。结果显示，FTD/TPI 和 SAS 联合治疗组的肿瘤生长明显慢于对照组和单药治疗组，肿瘤重量和体积显著降低，且联合治疗对小鼠体重及心、肝、肾、肺组织学无影响，表明联合治疗耐受性良好。
组织化学染色显示，联合治疗导致肿瘤组织腺体萎缩、缩小，KI67 和 SLC7A11 表达降低。这表明 SAS 可能通过靶向 SLC7A11 增强 FTD/TPI 对 CRC 生长的抑制作用，进一步证实了联合治疗的有效性。
在讨论部分，研究人员指出，转移性 CRC 患者预后较差，FTD/TPI 虽为晚期 CRC 的推荐治疗药物之一，但作用机制不明。本研究首次揭示 FTD/TPI 通过 p53 - SLC7A11 轴诱导铁死亡，且与 SAS 联合具有协同抑制 CRC 生长的作用。这一发现为 CRC 治疗提供了新的理论依据和治疗策略，也为进一步研究铁死亡在癌症治疗中的应用奠定了基础。未来，还需深入探究铁死亡相关的复杂分子调控机制，开发相关药物递送系统，建立生物标志物预测治疗反应和耐药性，以更好地将研究成果应用于临床实践，为 CRC 患者带来更多希望。
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