酒精性肝炎中C1Q+巨噬细胞的异质性特征及其在清除凋亡中性粒细胞中的双重作用

本研究针对酒精相关性肝硬化（AC）向重症酒精性肝炎（sAH）转化的炎症机制难题，通过单细胞测序技术揭示了肝脏巨噬细胞的异质性特征，首次鉴定出sAH特有的C1Q+巨噬细胞亚群，证实其通过表达吞噬和炎症相关基因在清除凋亡中性粒细胞中发挥关键作用，并利用基因敲除小鼠模型验证了APOE在抑制酒精性肝损伤中的保护功能，为靶向巨噬细胞的免疫治疗提供了新思路。

酒精性肝病（ALD）是全球最常见的慢性肝病之一，其疾病谱包括从单纯性脂肪变性到脂肪性肝炎、肝硬化乃至肝细胞癌（HCC）的系列病理改变。其中，酒精相关性肝硬化（AC）患者可能发展为重症酒精性肝炎（sAH），这是一种以黄疸和门静脉高压并发症为特征的严重临床综合征，短期死亡率极高。目前，早期肝移植仍是唯一有效的根治性治疗方法。

尽管sAH以显著肝脏炎症为特征，但针对炎症通路的治疗策略却屡遭挫折。多项临床试验试图通过靶向TNF-α或IL-1β等炎症介质治疗sAH，但均未取得理想效果。这可能是由于单一靶点策略难以应对sAH中复杂的炎症网络，或者真正的炎症驱动因素尚未被识别。因此，深入解析sAH的炎症机制，寻找关键细胞群体和分子靶点，成为当前研究的迫切需求。

先前研究发现sAH肝脏中存在大量炎症细胞浸润，主要包括巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞。特别是IL-8⁺中性粒细胞在sAH肝脏中高度富集，这些细胞能够自我维持，通过产生IL-8招募更多中性粒细胞，形成炎症恶性循环。与此同时，巨噬细胞浸润也在sAH中显著增加，但其具体作用和异质性特征仍不明确。

为系统解析sAH中巨噬细胞的多样性特征和功能作用，Yang Wang、Yukun Guan等研究人员开展了一项综合研究，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量RNA测序和多重免疫荧光染色等技术，对sAH和AC患者的肝脏巨噬细胞进行了全面表征。研究成果发表在《Cellular & Molecular Immunology》上，为理解酒精性肝炎的发病机制提供了新的视角。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用单细胞RNA测序分析5名健康对照、3名AC患者和5名sAH患者的肝脏细胞以及3名AC患者和4名sAH患者的外周血白细胞；通过批量RNA测序分析健康对照、AC和sAH患者的肝脏组织基因表达谱；采用多重免疫荧光染色技术对9名健康对照、9名AC患者和10名sAH患者的肝脏组织进行空间定位分析；使用慢性加单次暴饮乙醇喂养模型和Ad-Cxcl1过表达模型评估基因敲除小鼠的酒精性肝损伤表型。

Kupffer细胞被浸润的单核来源巨噬细胞替代

研究人员通过IBA1和MARCO双重染色发现，健康对照肝脏中约80-90%的巨噬细胞是共表达IBA1和MARCO的Kupffer细胞（肝脏定居巨噬细胞）。而在sAH患者中，约90%的巨噬细胞为单核来源的巨噬细胞（MoMFs），它们表达IBA1但不表达MARCO，表明Kupffer细胞在sAH中被大量替代。AC患者的Kupffer细胞仅在某些肝细胞结节中保留，纤维化区域中的所有巨噬细胞均为MoMFs。

批量RNA-seq分析显示，Kupffer细胞标志物（MARCO、CD5L和TIMD4）在AC和sAH患者中显著下调，而MoMF标志物（TREM2、GPNMB和SPP1）则显著上调。这些标志物的表达与MELD评分密切相关：Kupffer细胞标志物与MELD评分呈负相关，而MoMF标志物与MELD评分呈正相关。

scRNA-seq鉴定sAH肝脏中的炎症和吞噬性C1Q⁺巨噬细胞

通过分析scRNA-seq数据，研究人员在sAH肝脏中鉴定出13种巨噬细胞亚型，包括C1Q⁺、S100A8⁺、APOE⁺、TNF⁺和VSIG4⁺巨噬细胞。其中，C1Q⁺巨噬细胞是sAH特有的群体，表达多种与吞噬功能、促炎和抗炎功能相关的基因，表明其在sAH中具有多样功能。

C1Q⁺巨噬细胞表达Kupffer细胞标志物（MARCO、FOLR2、SUCNR1等）、促炎基因（IL-1B和CXCL8/IL-8）和抗炎基因（IL-10），同时还高表达与铁和脂质代谢相关的基因。这些特征表明C1Q⁺巨噬细胞在sAH中可能扮演多重角色。

巨噬细胞特征基因表达的验证

批量RNA-seq分析证实sAH患者中巨噬细胞特征基因的上调。多重免疫荧光染色进一步在蛋白水平验证了这些发现，显示MoMFs表达CD11C、CD74、LGMN、SPP1、APOE和CD36。这些结果提示MoMFs在sAH中参与蛋白降解和脂质代谢等多种功能，突出了它们在肝脏病理中的功能异质性。

巨噬细胞与sAH中凋亡中性粒细胞积累的相互作用

主成分分析（PCA）显示健康对照、AC和sAH患者的基因表达模式明显不同。差异表达分析发现sAH患者肝脏中与中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞凋亡和凋亡细胞清除相关的基因显著上调，表明ALD中存在凋亡中性粒细胞的积累。

免疫荧光染色显示sAH患者肝脏中中性粒细胞占总肝细胞的10%以上，而AC患者中不到5%。TUNEL和MPO双重染色发现sAH患者中TUNEL⁺细胞显著多于AC患者，且大多数凋亡细胞为中性粒细胞。sAH患者中约90%的MPO⁺中性粒细胞为TUNEL⁺，而AC患者中这一比例仅为20%左右。

空间分布分析显示sAH患者中性粒细胞与巨噬细胞的最近距离小于8μm，且60-70%的中性粒细胞位于巨噬细胞10μm范围内，表明两者存在密切的空间关联和潜在的相互作用。

C1q KO小鼠表现出与WT小鼠相似的酒精性肝损伤

为评估C1Q在ALD中的作用，研究人员使用10天慢性加暴饮乙醇喂养模型处理WT和C1q KO小鼠。两组小鼠表现出相似的肝损伤和肝中性粒细胞浸润水平，血清ALT和AST水平、巨噬细胞和中性粒细胞浸润、纤维化和脂肪变性均无显著差异。在乙醇喂养加Cxcl1过表达的模型中，WT和C1q KO小鼠的血清ALT和AST水平均显著升高，但两组间仍无统计学差异。C1q KO小鼠缺乏表型可能是由于所用ALD模型的肝损伤和炎症程度较轻。

巨噬细胞特异性S100a8敲除小鼠表现出与WT小鼠相似的酒精性肝损伤

研究人员还构建了巨噬细胞特异性S100a8 KO小鼠（S100a8^f/fX3cr1Cre）、Kupffer细胞特异性S100a8 KO小鼠（S100a8^f/fClec4fCre）以及Kupffer细胞和巨噬细胞双特异性S100a8 KO小鼠（S100a8^f/fClec4fCre/X3cr1Cre）。这些敲除小鼠与WT对照小鼠在10天慢性加暴饮乙醇喂养后，肝损伤和炎症指标均无显著差异。在乙醇加Ad-Cxcl1模型中，巨噬细胞特异性S100a8 KO小鼠也表现出与WT小鼠相似的肝损伤程度。

Apoe KO小鼠对酒精性肝损伤更敏感

由于APOE在肝修复中的作用尚未明确，研究人员对WT和Apoe KO小鼠进行10天慢性加暴饮乙醇喂养。Apoe KO小鼠表现出对酒精性肝损伤的敏感性增加，血清ALT和AST水平显著升高，肝中性粒细胞浸润增加，纤维化和脂肪变性加剧。

RNA-seq分析显示乙醇喂养的Apoe KO小鼠肝脏中有545个基因显著上调，132个基因下调。Reactome通路分析突出显示了中性粒细胞脱颗粒、细胞外基质组织和胶原形成等关键通路的改变。中性粒细胞脱颗粒相关基因在乙醇喂养的Apoe KO小鼠中显著上调。鉴于巨噬细胞来源的Apoe在肺纤维化消退中的关键作用，Apoe⁺巨噬细胞可能有助于酒精性肝损伤中肝纤维化的消退。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次通过整合scRNA-seq、批量RNA-seq和多重免疫荧光染色对AC和sAH中的肝脏巨噬细胞进行了全面表征，揭示了巨噬细胞的异质性特征和功能多样性。研究发现AC和sAH中Kupffer细胞减少了约90%，被MoMFs大量替代。sAH患者特有的C1Q⁺巨噬细胞可能通过清除凋亡中性粒细胞在疾病中发挥复杂作用。

研究表明sAH肝脏中存在大量凋亡中性粒细胞，且这些细胞与巨噬细胞空间位置密切，提示两者之间存在重要的相互作用。C1Q⁺巨噬细胞可能具有双重角色：一方面通过清除死亡细胞发挥保护作用，另一方面可能促进炎症反应。APOE在酒精性肝损伤中显示保护作用，Apoe KO小鼠对酒精性肝损伤更敏感，肝纤维化加剧。

这些发现为了解酒精性肝炎的发病机制提供了重要见解，为开发针对巨噬细胞的治疗策略奠定了基础。虽然直接靶向特定的巨噬细胞亚群可能面临挑战，但调节巨噬细胞向肝脏的迁移和活化可能为AH和AC患者提供治疗益处。未来的研究需要进一步阐明不同巨噬细胞亚群在ALD中的具体功能机制，并探索靶向这些细胞的治疗潜力。