抗生素是人类对抗细菌感染的重要武器，但随着抗菌药物耐药性(AMR)问题的日益严峻，许多传统抗生素正在逐渐失效。世界卫生组织(WHO)已将肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)等多重耐药(MDR)肠杆菌科细菌列为亟需新治疗策略的关键病原体。这些病原体可导致肠道、肺部、尿路等多种感染，尤其在免疫力低下人群中危害严重。然而，目前针对这些细菌的预防性疫苗仍十分有限。
传统疫苗平台如减毒活疫苗、灭活全菌疫苗、结合疫苗等，往往难以提供广泛的免疫保护，且很少能实现对多种细菌亚型的交叉保护。mRNA疫苗技术的出现为这一困境带来了转机。其在抗击SARS-CoV-2中的成功应用，展示了其快速开发、高免疫原性、可同时编码多种抗原等优势。能否利用mRNA技术平台，开发出能对抗多种耐药细菌的广谱疫苗，成为研究人员关注的焦点。
在这项发表于《npj Vaccines》的研究中，由刘锐、徐实、刘上等共同完成，蔡亚飞和黄体云作为共同通讯作者的团队，报道了他们开发的新一代mRNA疫苗。该研究瞄准了两个新颖的抗原靶点：磷酸盐特异性转运蛋白(PstS)和DUF3748结构域蛋白(YidR)。PstS是细菌磷酸盐转运系统的重要组成部分，在磷酸盐限制条件下对细菌生存至关重要，此前研究显示其蛋白疫苗对家禽沙门氏菌感染有保护作用，但在哺乳动物中的潜力未知。YidR则是一种在多种MDR菌株中高度保守的蛋白，介导细菌粘附和侵袭。研究人员设想，将这两个抗原融合，或许能开发出具有广谱保护作用的mRNA疫苗。
为验证这一设想，研究人员开展了一系列实验。他们首先构建了多种mRNA疫苗构建体，分别编码单独的PstS抗原、或PstS与YidR的不同融合形式（如KV1、KV2、KV3针对肺炎克雷伯菌；EV1、EV2、EV3针对EHEC；SV1、SV2针对沙门氏菌）。这些mRNA序列经过密码子优化，并融合了人免疫球蛋白重链恒定区γ1蛋白(IGHG1)的Fc段和STABILON(Stab)元件以增强抗原稳定性和免疫原性。利用体外转录(IVT)合成mRNA后，采用微流控技术将其封装在SM-102脂质纳米粒(LNP)中，形成mRNA-LNP制剂。研究的关键技术方法包括：质粒构建与mRNA体外转录、脂质纳米粒(LNP)封装与表征、蛋白质印迹法(Western Blotting)分析体外抗原表达与分泌、使用BALB/c小鼠模型进行免疫保护效力评价（包括攻毒实验、细菌载量测定、组织病理学分析）、间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体滴度、16S rRNA测序分析肠道微生物群变化、以及蛋白质序列比对分析抗原保守性。
PstS-containing mRNA vaccines exhibit prophylactic effect against K. pneumoniae infection
研究人员首先在肺炎克雷伯菌感染模型中测试了疫苗效果。Western Blotting证实KV1(PstS)、KV3(PstS-YidR)等构建体能在体外高效表达并分泌抗原。小鼠经两次免疫后，通过鼻内感染肺炎克雷伯菌。结果显示，与PBS对照组相比，KV1和KV3免疫组小鼠肺部细菌载量显著降低，其中KV3效果尤为突出，降低了约180倍。组织病理学分析也表明，KV3免疫能更好地维持肺泡结构完整性，减轻炎症浸润。这表明编码PstS或PstS-YidR融合抗原的mRNA疫苗能有效预防小鼠肺炎克雷伯菌肺部感染。
PstS-containing mRNA vaccines provide prophylactic protection against EHEC infection
接着，研究转向肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染模型。针对EHEC构建的mRNA疫苗（EV1, EV3）同样显示出良好的体外表达和分泌。小鼠免疫后，经抗生素预处理和EHEC灌胃攻毒。结果发现，疫苗接种组小鼠结肠和回肠的细菌载量比PBS对照组显著降低约75%-80%。结肠病理切片显示，疫苗免疫能明显减轻肠道绒毛损伤和炎症细胞浸润。这表明基于PstS的mRNA疫苗也能有效预防EHEC感染。
PstS-containing mRNA vaccines are effective in protecting against S. enterica infection
在沙门氏菌(S. enterica)感染模型中，研究人员构建了SV1(PstS)和SV2(PstS-YidR)疫苗。有趣的是，只有SV1（仅含PstS抗原）显示出保护作用，能显著降低粪便、脾脏和肝脏中的细菌载量，并减轻空肠、脾脏的组织损伤。而SV2（PstS-YidR融合抗原）则未表现出明显的预防效果。研究人员推测，这可能是由于抗原融合影响了SV2的分泌效率或蛋白稳定性。
mRNA vaccine encoding conserved PstS and YidR antigens exhibit cross-protective effect against multiple MDR Enterobacteriaceae infections
序列同源性分析显示，PstS和YidR在肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门氏菌和福氏志贺菌(S. flexneri)这四种肠杆菌科细菌中具有高度保守性（PstS同源性>89%，YidR>78%），而在奇异变形杆菌(P. mirabilis)中同源性较低。基于此，研究人员测试了基于肺炎克雷伯菌抗原的KV3疫苗是否具有交叉保护作用。令人振奋的是，KV3不仅能有效对抗肺炎克雷伯菌和EHEC的感染，在沙门氏菌和福氏志贺菌感染模型中也显示出显著的保护效果：能降低各器官的细菌载量，减轻肠道、肾脏等组织的病理损伤，并缓解感染导致的体重下降。然而，KV3对奇异变形杆菌感染则无保护作用，这与序列同源性较低的结果一致。抗体滴度检测显示，KV3免疫后能诱导高水平的PstS特异性IgG和中等水平的YidR特异性IgG。
mRNA vaccine has minimal impact on the diversity of intestinal microbiota in mice
考虑到肠杆菌科某些成员是肠道常驻菌群，研究人员通过16S rRNA测序评估了KV3疫苗接种对小鼠肠道微生物群多样性的影响。α-和β-多样性分析表明，尽管在免疫后第7天和第28天肠道菌群多样性出现波动，但在第42天时基本恢复到免疫前水平。在门水平和科水平上，某些菌群（如厚壁菌门/Firmicutes、毛螺菌科/Lachnospiraceae）的相对丰度在免疫期间有短暂变化，但随后均恢复。重要的是，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的相对丰度在所有时间点均未发生显著变化。此外，PstS与小鼠基线时五种主要肠道共生菌家族的同源性分析显示几乎不存在交叉反应的可能性。这表明KV3对小鼠肠道菌群多样性的影响是暂时的、可恢复的。
讨论与结论
本研究成功开发了针对多重耐药肠杆菌科细菌的新一代mRNA疫苗。研究首次证实PstS可作为哺乳动物抗细菌感染疫苗的有效靶点。基于高度保守的PstS和YidR抗原设计的mRNA疫苗，尤其是PstS-YidR融合疫苗KV3，在动物模型中显示出针对肺炎克雷伯菌、EHEC、沙门氏菌和福氏志贺菌四种重要病原体的强效且广谱的保护作用。这种交叉保护效应与抗原在不同菌种间的高序列保守性密切相关。
研究还揭示了抗原融合策略的重要性。融合抗原的构型会影响蛋白的表达、分泌和稳定性，进而影响疫苗效果。例如，在肺炎克雷伯菌和EHEC模型中，PstS-YidR融合疫苗（KV3, EV3）表现出色；但在沙门氏菌模型中，类似的融合构建体（SV2）则无效，而单独的PstS疫苗（SV1）有效。这表明在开发多价或融合抗原疫苗时，需要仔细优化抗原的组合和结构。
该mRNA疫苗平台采用LNP递送系统，其本身具有一定的自我佐剂效应，能有效激发免疫反应。尽管本研究主要评估了疫苗激发的体液免疫反应（特异性IgG），但m疫苗平台通常也能诱导细胞免疫，这对于清除像沙门氏菌、志贺氏菌这类兼性胞内病原体可能尤为重要，未来研究可进一步探讨其细胞免疫机制。
安全性方面，KV3疫苗接种仅引起小鼠肠道菌群短暂、可逆的变化，对肠杆菌科常驻菌群无明显影响，且抗原与主要共生菌无交叉反应风险，提示其具有良好的安全性特征。
总之，该研究不仅为对抗日益严峻的细菌耐药性问题提供了一种新颖、有效的疫苗策略，证实了PstS作为广谱疫苗靶点的潜力，也展示了mRNA疫苗平台在应对多病原体威胁时的灵活性和强大潜力。这种能够减少抗生素依赖、降低医院感染风险的细菌疫苗技术，为未来人类和动物细菌感染预防的临床研究奠定了基础，具有重要的转化应用前景。
