MEN1调控脂质过氧化与铁死亡在肺癌细胞中的作用
研究团队发现，在肺癌细胞中，MEN1的表达水平与铁死亡的敏感性密切相关。利用短发夹RNA（shRNA）敲低或CRISPR/Cas9技术敲除（KO）MEN1基因后，负向调控铁死亡的关键蛋白GPX4的表达显著上调。相反，过表达MEN1（oeMEN1）则会降低GPX4的水平。功能实验表明，MEN1缺陷的肺癌细胞（如A549、NCI-H460）对铁死亡诱导剂（如erastin、RSL3）的敏感性降低，表现为活性氧（ROS）和脂质过氧化物的积累减少。而重新引入MEN1（rMEN1）可逆转这种表型。透射电镜观察进一步证实，MEN1缺失导致线粒体形态异常（如线粒体肿胀、嵴结构破坏），这与铁死亡的典型特征相符。非靶向代谢组学分析揭示，MEN1敲除细胞的代谢谱发生显著改变，特别是鞘脂代谢通路富集，提示MEN1通过调节代谢重编程影响铁死亡。
MEN1调控的铁死亡对抑制肺肿瘤生长和转移至关重要
体外功能实验显示，MEN1缺陷显著增强了NCI-H460细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在免疫缺陷M-NSG小鼠体内构建的实验性肺转移模型中，尾静脉注射MEN1敲除的NCI-H460细胞后，肺部转移瘤的负荷、数量以及增殖标志物Ki67和转移相关蛋白HMGB1的表达均显著高于野生型（WT）细胞对照组。为了在自发肿瘤模型中验证，研究者构建了KrasG12D 驱动、Sftpc-CreER 介导的肺腺癌（LUAD）小鼠模型（KS），并进一步与Men1条件性敲除小鼠杂交获得KMS小鼠。结果显示，与KS小鼠相比，KMS小鼠的肿瘤负荷、肿瘤数量显著增加，生存期明显缩短。重要的是，KMS小鼠肺组织中脂质过氧化水平降低，而GPX4的表达升高，表明Men1的缺失通过抑制铁死亡加速了肿瘤进展。
MEN1对肺癌细胞铁死亡的调控依赖于CD44变异亚型
对KS和KMS小鼠肺组织进行RNA测序（RNA-seq）分析，发现Men1缺失导致细胞外基质（ECM）和细胞粘附分子相关通路基因显著富集。其中，CD44作为重要的细胞粘附分子，其变异剪接亚型（如CD44v3, CD44v6, CD44v9）在KMS小鼠的肺肿瘤组织中表达显著上调。临床样本分析表明，在人类肺癌组织中，CD44变异体（尤其是CD44v6和CD44v9）的mRNA和蛋白水平与GPX4表达呈正相关，且高CD44百分数剪接指数（PSI）与患者的不良预后相关。在细胞模型中，MEN1敲除促进了PMA诱导的CD44v6表达。功能挽救实验证实，敲低CD44v6（siV6）可以部分逆转MEN1缺失导致的GPX4上调、erastin诱导的脂质过氧化抑制以及细胞对铁死亡诱导剂的抵抗。这表明MEN1主要通过抑制CD44变异体的生成来维持铁死亡敏感性。
MEN1通过抑制RNA可变剪接阻止CD44变异体的产生
CD44基因包含多个恒定外显子和可变外显子（v1-v10）。RT-PCR和qPCR分析显示，在Men1全身性敲除（Men1Δ/Δ ）小鼠的肺组织、KMS小鼠的肺肿瘤组织以及MEN1敲除的NCI-H460细胞中，多种CD44变异体（v3-v10）的mRNA和蛋白水平均显著升高。通过DRB（5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-呋喃核糖苷）释放实验评估转录延伸速率，发现MEN1缺失加快了RNA聚合酶II（Pol II）在CD44基因体上的延伸速度。剪接报告基因实验（pETCatEBLucv6）进一步证明，MEN1缺失促进了CD44可变外显子v6的包含。这些结果说明MEN1通过减缓Pol II的转录延伸，影响了CD44前体mRNA的剪接效率，从而抑制了变异体的产生。
Menin通过招募PAF1调控Pol II从CD44基因体的释放
机制探索表明，MEN1调控剪接的核心在于影响Pol II的暂停和释放。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验显示，MEN1缺失导致Pol II（使用识别总Pol II的8WG16抗体和识别CTD的4H8抗体）在CD44基因启动子近端区域（如内含子1，i1）的富集减少，而磷酸化Pol II（Ser2，延伸标志）在基因体内部的富集增加。这表明MEN1缺失促进了Pol II从暂停状态向延伸状态的转变。进一步研究发现，PAF1（Pol II相关因子1）在这一过程中起关键作用。MEN1缺失增强了PAF1在CD44基因不同区域（包括启动子近端和可变外显子区域）的染色质结合。敲低PAF1（siPAF1）可以减缓MEN1缺失导致的Pol II快速延伸，并部分恢复CD44变异体pre-mRNA的生成。RNA免疫共沉淀（RIP）实验表明，MEN1缺失还影响了剪接因子如ESRP1和hnRNPLL在CD44可变外显子剪接位点的招募。综合来看，MEN1通过调控PAF1的招募，影响Pol II的磷酸化状态（Ser5暂停 vs Ser2延伸）和延伸速率，进而改变剪接因子的结合动力学，最终决定CD44可变外显子的包含与否。
CD44变异体-GPX4信号轴在肺癌中上调并与不良预后相关
对115例人类肺癌临床样本的分析显示，与癌旁正常组织相比，肿瘤组织中CD44多种变异体（v3, v5, v6, v9）和GPX4的mRNA及蛋白表达均显著上调。CD44v6的高表达与肿瘤分期、淋巴结转移等不良临床病理特征正相关。公共数据库（如TCGA）分析证实，GPX4高表达的LUAD患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）更短。相反，MEN1在肺癌组织中的表达低于正常组织，且低MEN1表达结合高CD44 PSI预示着更差的预后。这提示MEN1-CD44变异体-铁死亡轴在肺癌发生发展中扮演重要角色。
CD44v6多肽通过重新激活铁死亡抑制已形成肺癌的生长和转移
最后，研究团队评估了靶向CD44v6的治疗潜力。在已形成原发性肺肿瘤的KS和KMS小鼠模型中，腹腔注射小鼠CD44v6干扰肽（mv6pep）或铁死亡诱导剂erastin，持续3周。结果显示，与对照肽（Ctrlpep）组相比，mv6pep和erastin治疗均能显著抑制肿瘤生长，表现为肺重、肿瘤负荷和数量的减少，以及Ki67阳性率的下降。更重要的是，mv6pep治疗显著增加了肺组织中的铁含量、脂质过氧化水平和4-羟基壬烯醛（4HNE）的表达，同时降低了GPX4的表达，表明铁死亡被重新激活。在实验性转移模型中，尾静脉注射人源CD44v6干扰肽（hv6pep）也能有效抑制MEN1敲除NCI-H460细胞在M-NSG小鼠体内形成的转移瘤，并伴随铁死亡标志物的变化。值得注意的是，CD44v6干扰肽对MEN1缺失的肿瘤表现出更强的抑制效果，提示其对MEN1缺陷型肺癌具有潜在的特异性治疗价值。
综上所述，本研究阐明了MEN1作为一个关键的肿瘤抑制因子，通过调控PAF1介导的Pol II延伸速率，影响CD44前体mRNA的可变剪接，从而控制CD44变异体的生成，并最终通过调节铁死亡通路抑制肺癌的进展。这为理解MEN1的肿瘤抑制功能提供了新的视角，并为治疗MEN1缺失的肺癌提供了新的靶点策略。
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