肝脏胰高血糖素信号调控寿命的性别二态性：胰岛素敏感性与长寿的解耦
摘要
胰高血糖素作为空腹状态下维持血糖稳定的关键激素，同时具有调节脂质氧化、肥胖程度、胰岛素敏感性和代谢率等广泛代谢效应。然而，其在衰老和寿命调控中的作用尚未被充分探索。本研究通过肝脏特异性胰高血糖素受体敲除（LKO）小鼠模型，揭示了肝脏GCGR信号对寿命的性别二态性调控。虽然雄性LKO小鼠寿命正常，但雌性LKO小鼠存活时间显著缩短。值得注意的是，这种寿命缩短现象与代谢健康的显著改善同时存在，包括体重和肥胖程度降低、葡萄糖氧化偏好性增强、代谢率升高以及成年期葡萄糖耐量和胰岛素敏感性提升。转录组和生化分析显示，老年雌性LKO小鼠肝脏和肾脏中促炎通路（特别是NF-κB和cGAS-STING信号）被特异性激活，同时肝脏外源性代谢基因表达下调。这些发现确立了肝脏胰高血糖素受体在调控寿命中的新型性别二态性作用，揭示了雌性个体中该信号中断与晚年炎症反应增强和寿命缩短之间的关联。
引言
胰高血糖素传统上被视为胰岛素作用的拮抗剂，是由胰腺胰岛α细胞分泌的29个氨基酸肽类激素。空腹或氨基酸刺激引发的低血糖状态会触发胰高血糖素释放进入循环系统，并通过与胰高血糖素受体（GCGR）结合发挥生理效应。经典胰高血糖素作用机制涉及GCGR激活后刺激细胞内cAMP积累和后续cAMP反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化，最终通过诱导糖异生和糖原分解基因转录来升高血糖。除维持餐间血糖稳定外，GCGR激动和敲除均能改善胰岛素敏感性。此外，胰高血糖素还能急性升高啮齿类和人类的能量消耗，并刺激肝脏脂解作用。
饮食限制是研究最深入且最著名的延长哺乳动物寿命的途径之一。尽管胰高血糖素参与空腹反应，但其在衰老过程中的作用尚未得到系统研究。本研究通过肝脏特异性GCGR敲除模型直接探究胰高血糖素在衰老中的作用。研究发现LKO小鼠虽表现出改善的代谢健康指标，但雌性LKO小鼠存活时间显著缩短，而雄性寿命不受影响。转录组和蛋白质分析揭示雌性特异性促炎通路激活和外源性代谢基因表达变化，这些发现挑战了胰岛素敏感性增强必然延长寿命的假设，强调了衰老研究中性别特异性机制的重要性。
结果
雌性肝脏GCGR缺失小鼠寿命缩短
通过Cre/LoxP介导的肝脏特异性GCGR敲除模型验证发现，GCGR表达仅在小肝脏中降低。寿命分析显示，当性别合并分析时，LKO小鼠寿命无显著差异（CRE-中位寿命804天，LKO中位寿命755天）。性别分层分析表明，雄性小鼠寿命无差异（CRE-中位801天，LKO中位785天），而雌性LKO小鼠寿命显著缩短（CRE-中位813天，LKO中位685天，减少19%）。Cox比例风险分析显示雌性LKO小鼠风险比显著升高至1.8391。分位数回归分析进一步证实雌性LKO小鼠在75百分位生存时间显著缩短。
肝脏GCGR缺失抵抗年龄相关肥胖
雄性小鼠3月龄前和雌性小鼠8月龄前体重无差异，但此后LKO小鼠体重显著低于同性别CRE-对照。1年龄体成分分析显示雄性和雌性LKO小鼠脂肪质量显著降低，雌性LKO小鼠瘦体重显著增加。校正体重差异后，LKO小鼠脂肪质量显著降低而瘦体重显著升高。老年期（21-22月龄）LKO小鼠皮下和内脏白色脂肪沉积明显减小，白色脂肪沉积与体重比值显著降低。脑、肾和胰腺与体重比值在LKO小鼠中显著升高。
肝脏GCGR缺失提升葡萄糖利用和胰岛素敏感性
间接 calorimetry 实验显示LKO小鼠呼吸交换比（RER）显著升高，表明机体能量需求更依赖葡萄糖供能。校正体重后，LKO雄性小鼠能量消耗升高，雌性LKO小鼠基因型与体重对能量消耗存在显著交互作用。LKO小鼠葡萄糖氧化速率显著升高，脂肪氧化速率显著降低。腹腔葡萄糖耐量试验显示LKO小鼠血糖在各时间点均显著降低，胰岛素耐量试验表明LKO小鼠胰岛素敏感性显著增强。
雌性GCGR缺失小鼠炎症基因表达增加
对20-22月龄小鼠肝脏进行RNA测序发现，雄性LKO小鼠有339个差异表达基因（DEGs），雌性LKO小鼠有1812个DEGs，其中1679个为雌性特有。基因集富集分析显示，炎症反应、干扰素γ反应、补体和氧化磷酸化等通路在雌雄LKO小鼠中呈现相反调控趋势。炎症相关基因集中检测到73个DEGs，表明雌性LKO小鼠存在独特的炎症激活状态。
雌性GCGR缺失小鼠NF-κB和cGAS-STING信号激活
京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库富集分析显示，NF-κB信号通路是最显著富集的通路。Western blot证实雌性LKO小鼠肝脏中STING、cGAS和磷酸化IκBα水平升高，肾脏中STING和磷酸化IκBα也显著升高。RT-qPCR进一步显示雌性LKO小鼠肾脏免疫相关基因表达增加，而白色脂肪组织中未观察到类似变化。
雌性GCGR缺失小鼠外源性代谢基因表达降低
基因集富集分析发现雌性LKO小鼠外源性代谢基因集显著下调。RNA-seq数据中该基因集的29个DEGs中有28个在雌性LKO肝脏中显著下调，而雄性LKO肝脏中仅4个基因下调。这与长寿模型中外源性代谢基因上调的现象形成鲜明对比。
讨论
遗传操作内分泌通路对于解析衰老调控机制具有关键作用。本研究显示LKO小鼠存在显著寿命性别二态性：雌性存活时间显著缩短而雄性不受影响。尽管成年期代谢指标改善，雌性LKO小鼠仍呈现寿命缩短。转录组和蛋白质分析揭示雌性LKO小鼠NF-κB/cGAS-STING通路激活和外源性代谢基因表达下调，这些变化通常与寿命延长相关。本研究结果挑战了代谢益处必然延长寿命的假设，强调了衰老研究中性别特异性视角的重要性。
寿命分析显示雌性LKO小鼠生存率显著降低，而雄性寿命无变化。雌性LKO小鼠75百分位最大生存期缩短，这与生长激素突变小鼠、Fgf21转基因小鼠以及长期热量限制或蛋氨酸限制模型中的寿命延长现象形成对比。这些发现与Nelson等人关于胰岛素敏感性增强不一定促进长寿的报告一致，质疑了代谢改善必然延长寿命的传统观点。
先前研究报道全身性GCGR敲除小鼠两性寿命均显著缩短，但该模型存在脱靶效应。我们推测LKO模型中非肝脏组织的残余GCGR活性可能解释寿命的性别差异，提示组织特异性胰高血糖素信号在衰老中的复杂作用。
为探究LKO小鼠生存差异，我们检测了肝脏和肝外炎症谱，发现短寿雌性LKO小鼠NF-κB信号显著上调。这与先前研究显示NF-κB激活缩短寿命、其抑制延长寿命的结果一致。雌性LKO小鼠肝脏和肾脏中cGAS和STING蛋白水平升高提示了NF-κB激活机制，因为cGAS-STING信号驱动NF-κB活性并与年龄相关疾病的性别依赖性进展相关。这些发现表明肝脏GCGR缺失触发雌性特异性cGAS-STING/NF-κB介导的系统性炎症，导致寿命缩短。
此外，雌性LKO小鼠肝脏外源性代谢基因表达下调，而雄性无此现象。这类基因（特别是细胞色素P450s）在长寿模型中通常上调，且与寿命正相关。其在雌性LKO小鼠中的抑制可能促进寿命缩短。有趣的是，尽管雄性和雌性LKO小鼠Fgf21表达均升高，但未观察到寿命延长，这与Fgf21过表达转基因小鼠（特别是雌性）的寿命延长现象形成对比，提示FGF21的延寿效应可能需要完整的肝脏胰高血糖素信号。
需要指出的是，实验小鼠在发育期和成年期均缺乏GCGR，因此无法确定寿命差异是源于关键发育窗口的肝脏GCGR缺失，还是终生肝脏GCGR抑制的累积效应。先前研究表明，早期营养限制和生长激素替代能显著改变衰老进程，提示发育关键窗口的存在是本研究模型的重要限制因素。未来研究需要通过时序控制GCGR缺失来解析终生与成年期GCGR中断的影响。
方法
小鼠模型采用LoxP位点环绕Gcgr基因6-12外显子的floxed-Gcgr小鼠与Albumin-Cre小鼠交配获得。所有小鼠维持于C57BL/6J遗传背景，在无特定病原体设施中群养，自由摄食饮水。寿命分析采用log-rank检验和Cox比例风险模型，最大寿命评估使用分位数回归法。体成分通过定量磁共振分析，能量代谢采用间接 calorimetry 系统监测。葡萄糖和胰岛素耐量试验分别通过腹腔注射葡萄糖和胰岛素进行。RNA测序采用NovaSeq X平台进行，生物信息学分析使用STAR、DESeq2和clusterProfiler等工具。Western blot和RT-qPCR分别用于蛋白质和基因表达验证。
结论
本研究首次揭示肝脏胰高血糖素信号通过性别特异性机制调控寿命。雌性小鼠肝脏GCGR缺失导致代谢改善与寿命缩短的解离现象，其机制涉及NF-κB/cGAS-STING炎症通路激活和外源性代谢能力下降。这些发现不仅拓展了对胰高血糖素生理功能的认识，还为理解衰老的性别差异提供了新视角，对开发性别特异性抗衰老策略具有重要启示。
