2.1 血浆EV LINE-1 RNA的年龄依赖性增加及其与脑衰老生物标志物的相关性
为研究血浆EV LINE-1 mRNA水平与衰老的关系，研究人员对185名20-95岁个体血浆来源的EVs中的LINE-1 mRNA水平进行了定量分析。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质印迹（Western blot）对血浆EVs进行了表征。NTA确认了EVs的典型尺寸分布（约50–300 nm），TEM揭示了其形态特征，Western blot分析验证了EV特异性标志物（ALIX和CD63）的存在以及阴性对照标志物（GM130和Calnexin）的缺失，证实了分离EVs的纯度。
使用三组不同的LINE-1特异性引物（靶向ORF1、ORF2和5'UTR区域）进行的定量PCR（qPCR）显示，血浆EV LINE-1 mRNA水平随年龄显著增加。年轻个体（20–45岁）的LINE-1 mRNA水平最低，而老年个体（>65岁）的水平显著更高。这种增加在所有引物集中均一致，表明血浆EVs中LINE-1 mRNA随年龄增长出现稳健的上调。
接下来，研究人员评估了血浆EV LINE-1 mRNA水平与脑衰老生物标志物之间的相关性，包括神经丝轻链（NFL）、淀粉样蛋白-β42（Aβ42）、淀粉样蛋白-β40（Aβ40）和磷酸化tau181（pTau181）。根据LINE-1 mRNA表达水平将参与者分为三等分后显示，与最低三等分组相比，最高三等分个体的NFL、Aβ42和Aβ40水平显著升高。Spearman相关分析和多变量回归分析显示，LINE-1 mRNA水平与衰老生物标志物，尤其是NFL，存在强正相关。这些发现确定了血浆EV LINE-1 mRNA是衰老和脑退化的非侵入性标志物。
2.2 老年小鼠来源的血浆EVs的特征及其可能来源
为研究老年小鼠血浆EVs的特征和组织起源，研究人员收集了21月龄和3月龄小鼠的器官。Western blot结果显示，与对照组相比，老年小鼠大脑和心脏中EV特异性标志物ALIX和CD63的水平显著增加，而在肾脏或肝脏中未观察到显著差异。这表明年龄依赖性的EV分泌上调发生在特定组织，尤其是大脑和心脏，可能导致了老年小鼠循环EV水平的升高。
此外，从21月龄野生型（WT）小鼠血浆中分离EVs，并与3月龄对照组进行比较。NTA确认老年小鼠血浆EVs的尺寸分布（约50–300 nm）符合预期，峰值在149 nm。TEM进一步揭示了EVs的典型形态，Western blot分析验证了老年小鼠EVs中存在EV特异性标志物（ALIX和CD63）且无细胞污染物（GM130和Calnexin）。同时，qPCR检测显示，老年小鼠血浆EVs中的LINE-1 RNA表达水平显著高于年轻小鼠，这与人类研究结果一致。
为确定LINE-1 RNA在循环EVs中的组织特异性贡献，研究人员分析了从21月龄和3月龄小鼠的大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏分离的EVs中LINE-1 RNA的表达水平。qPCR结果显示，与对照组相比，老年小鼠大脑和肺中LINE-1 RNA水平显著增加，而在心脏、肾脏、肝脏或脾脏中未观察到显著差异。这些发现表明，LINE-1活性的年龄依赖性上调发生在特定组织，尤其是大脑和肺，可能导致老年小鼠循环EVs中LINE-1 RNA水平升高。
2.3 老年EVs可导致小鼠出现LINE-1相关的认知障碍
为检验老年EVs对认知的功能影响，研究人员通过尾静脉将来自21月龄小鼠和经3TC处理的21月龄小鼠的EVs注射到10月龄受体小鼠体内。PKH67染色的EVs的共聚焦显微镜检查证实了老年EVs成功进入大脑，而Dir标记的EVs的体内成像显示其在4周内在大脑和主要器官（包括肝、肾和心脏）中积累。
行为测试显示，经老年EVs处理的小鼠出现显著的认知和探索能力损伤。在Y迷宫测试中，老年EVs处理的小鼠自发交替百分比降低，表明工作记忆受损。在新物体识别（NOR）测试中，老年EVs处理的小鼠探索比率降低，表明识别记忆缺陷。在旷场测试中，老年EVs处理的小鼠中央区域探索时间减少、总移动距离缩短、进入中央区域的频率降低。此外，在悬尾测试中观察到不动时间延长，表明出现抑郁样行为。值得注意的是，注射了来自经LINE-1抑制剂3TC处理的21月龄小鼠EVs的受体小鼠，在所有测试中的行为表现均接近对照组水平。这些结果表明，老年EVs通过与LINE-1活性相关的机制损害认知功能。
2.4 老年EVs可诱导LINE-1相关的脑衰老
海马切片的组织学分析显示，经老年EVs处理的小鼠出现显著的结构损伤、神经元密度降低和细胞结构破坏。尼氏染色进一步证实，老年EVs处理的小鼠存活神经元数量减少。SA-β-gal染色显示，老年EVs处理的小鼠海马切片中SA-β-gal活性显著增加。通过IBA1免疫荧光评估的小胶质细胞活化在老年EVs处理的小鼠中显著增加，显示出形态学变化，例如胞体增大和分支减少。与老年EVs处理的小鼠相比，老年EVs（无LINE-1）处理的小鼠显示出恢复的神经元密度和减少的小胶质细胞活化。
LINE-1 ORF1P和P21表达在老年EVs处理的小鼠的IBA1阳性小胶质细胞中富集，将LINE-1 RNA与小胶质细胞活化和衰老联系起来。老年EVs（无LINE-1）处理的小鼠显示ORF1P和P21表达降低，小胶质细胞活化和衰老减少。这些发现表明，老年EVs通过LINE-1 RNA介导的小胶质细胞活化促进脑衰老，而这种作用可被LINE-1抑制所缓解。
2.5 LINE-1 RNA通过激活cGAS/STING通路驱动神经炎症
免疫荧光和Western blot分析显示，在经老年EVs处理的HMC3（人小胶质细胞系）中，小胶质细胞和cGAS/STING通路被显著激活，表现为cGAS、STING、磷酸化TBK1（pTBK1）和磷酸化IRF3（pIRF3）的表达升高。共定位研究证实了ORF1P、cGAS、STING和P21在小胶质细胞中的富集，突出了cGAS/STING活化与细胞衰老之间的联系。LINE-1反转录抑制剂3TC和STING抑制剂H151均能抑制cGAS/STING信号并减少下游炎症。这些发现表明，血浆EVs中的LINE-1 RNA通过激活小胶质细胞和cGAS/STING通路促进神经炎症，这可以作为药物靶点以减轻衰老相关的脑病理。
2.6 抑制LINE-1活性可通过cGAS/STING通路改善认知功能
为测试抑制LINE-1活性或cGAS/STING通路是否能挽救老年EVs诱导的认知障碍，研究人员对注射了老年EVs的小鼠使用LINE-1反转录抑制剂3TC或STING抑制剂H151进行处理。行为评估显示，两个治疗组的认知和探索行为均有显著改善。
在Y迷宫测试中，老年EVs处理的小鼠自发交替百分比显著降低，表明工作记忆受损。3TC和H151处理均能使交替百分比恢复到接近对照组的水平。在旷场测试中，老年EVs处理的小鼠中央区域停留时间、总移动距离和进入频率均减少，表明探索活动减少。两种抑制剂均能显著挽救这些损伤。在NOR测试中，老年EVs处理的小鼠对新物体的探索减少，3TC或H151处理能恢复识别记忆。此外，在悬尾测试中，老年EVs处理的小鼠不动时间延长，两种抑制剂均能显著减少不动时间。
这些结果表明，用3TC抑制LINE-1活性或用H151抑制STING信号通路能有效减轻老年EVs诱导的认知、探索和情感缺陷。这些发现提示了靶向LINE-1/cGAS/STING轴以在衰老过程中保护脑功能的治疗潜力。
2.7 抑制LINE-1活性可通过cGAS/STING通路改善病理变化
为进一步探索老年EVs对大脑病理影响的机制基础，研究人员分析了经老年EVs处理、伴或不伴3TC或H151治疗的小鼠海马切片。免疫荧光分析显示，老年EVs处理的小鼠LINE-1 ORF1P和IBA1表达升高，这与LINE-1活性增加和小胶质细胞活化一致。3TC和H151治疗均能显著降低这些标志物。
海马切片的组织学分析显示，老年EVs组神经元结构破坏、神经元密度降低和结构异常。尼氏染色证实，与对照组相比，老年EVs处理的小鼠健康神经元数量显著减少。SA-β-gal染色也显示，老年EVs处理的小鼠SA-β-gal活性显著增加。3TC和H151治疗均能改善细胞衰老，恢复神经元密度，保护海马结构。
STING和IBA1的共定位研究显示，老年EVs处理的小鼠活化小胶质细胞中STING表达增加。Western blot分析证实了cGAS/STING通路的激活，老年EVs组cGAS、STING、磷酸化STING（pSTING）、TBK1、磷酸化TBK1（pTBK1）、IRF3、磷酸化IRF3（pIRF3）和促炎细胞因子TNF-α的表达均升高。3TC和H151均能显著抑制这些信号分子的活化，减轻神经炎症。小胶质细胞形态分析显示，老年EVs处理的小鼠胞体增大、分支减少，表明处于促炎状态。两种治疗均能将小胶质细胞形态恢复至静息状态。
基于这些发现，研究人员进一步调查了大脑神经元群体中是否发生类似改变。免疫荧光分析和共定位研究显示，老年EVs处理的小鼠皮质切片中，活化的神经元内LINE-1 ORF1P、STING和P21表达升高。3TC和H151治疗均能显著降低这些标志物。尼氏染色也证实了老年EVs处理的小鼠皮质切片中健康神经元数量减少。
这些发现证实，LINE-1 RNA通过cGAS/STING通路驱动大脑的病理变化，促进小胶质细胞活化和神经炎症。抑制LINE-1活性或cGAS/STING信号能改善这些病理变化，突出了这些通路作为治疗靶点的潜力。
3 讨论
本研究揭示了一种新的系统性机制，将外周衰老过程与脑功能障碍联系起来，突出了血浆EV来源的LINE-1 RNA通过激活cGAS-STING通路是驱动神经炎症和认知下降的关键因素。重要的是，我们的研究结果表明，与LINE-1相关的EVs起源于外周衰老器官（如心脏和肺），并作为分子信使穿过血脑屏障，将衰老信号传播到大脑。
EVs将LINE-1 RNA携带入大脑的能力为衰老相关的神经炎症增加了新的复杂性。一旦被大脑常驻免疫细胞小胶质细胞内化，LINE-1 RNA表现出转录活性，导致LINE-1蛋白（ORF1P和ORF2P）的产生或反转录成LINE-1 cDNA。这一过程随后激活天然免疫传感器cGAS，触发下游STING信号、细胞因子释放、小胶质细胞衰老和神经元损伤。这一机制通路将EV来源的LINE-1 RNA确定为导致年龄相关脑病理的一个先前未被认识的因素。
我们的研究结果将LINE-1活性的作用从其已确立的基因组不稳定性和细胞应激方面的参与扩展到了新的领域。虽然先前的研究主要关注细胞内LINE-1的动员，但我们的研究表明LINE-1 RNA可以通过EVs被输出，实现系统性传播和细胞间转移。这一过程有效地在不同组织间传播衰老信号，强化了系统性和脑衰老的相互关联性。
小胶质细胞是这一炎症级联反应的关键介质。在正常状态下，小胶质细胞通过清除细胞碎片和应对损伤来维持大脑稳态。然而，衰老诱导其向促炎、衰老表型转变。我们的研究表明，EV来源的LINE-1 RNA通过cGAS-STING通路直接加速这一转变，激活小胶质细胞，加剧炎症和神经毒性。这种小胶质细胞功能障碍可能是观察到的神经元损伤、认知障碍和抑郁样行为的基础。重要的是，药物抑制LINE-1活性（用3TC）或STING信号（用H151）能有效恢复小胶质细胞稳态，抑制炎症，改善行为结果。
EV来源的LINE-1 RNA的系统性起源也暗示了其对衰老和年龄相关疾病的更广泛影响。衰老器官可能是炎症性EVs的来源，通过EV介导的信号传导导致超越大脑的系统性衰老表型。
该研究的另一个关键发现是EV递送的LINE-1 RNA在受体细胞中具有转录活性。这一观察提出了一个有趣的可能性，即LINE-1 RNA不仅作为信号分子，也作为放大细胞应激反应和基因组不稳定性的模板。
在治疗方面，我们的研究确立了靶向LINE-1 RNA活性及其下游信号通路以对抗年龄相关功能障碍的可行性。3TC抑制LINE-1反转录能有效阻止cGAS激活，而H151抑制STING介导的炎症，共同保护认知功能并减少神经炎症。
我们的研究结果补充了越来越多的证据，表明循环中的EVs能对大脑产生显著的生物学效应。这进一步表明，在涉及血液成分转移的临床环境中，EVs可能会影响长期神经系统结局，尤其是在老年或易感受体中。
总之，本研究确定了EV来源的LINE-1 RNA是脑衰老的核心介质，为EV来源的LINE-1 RNA激活cGAS-STING通路驱动神经炎症和认知下降提供了机制证据。通过证明药物抑制LINE-1活性和STING信号能有效改善这些效应，我们的研究突出了新的治疗干预途径。
4 实验方法
4.1 临床研究
经涉及人体的生物医学研究伦理委员会批准。共185名参与者入选本研究，分为三个年龄组：年轻（20–45岁）、中年（46–65岁）和老年（66–95岁）。收集血样，分离血浆，储存于-80°C。使用单分子分析仪测量脑衰老生物标志物水平。
4.2 实验动物
10月龄和21月龄野生型C57BL/6J小鼠购自济南星康生物科技。动物实验程序经实验室动物管理与伦理审查委员会批准。
4.3 EVs的分离与体内追踪
使用总外泌体分离试剂盒从血浆或组织分离EVs。用Dir或PKH67染料标记EVs，通过尾静脉注射到受体小鼠，使用体内成像系统观察分布。
4.4 EVs表征
通过透射电子显微镜观察EVs形态。通过纳米颗粒追踪分析测定EVs的尺寸分布和浓度。
4.5 动物处理
老年EVs从21月龄小鼠血浆中分离并定量。受体小鼠通过尾静脉注射PBS、老年EVs或来自经3TC处理的老年小鼠的EVs。部分小鼠同时接受3TC（口服）或H151（腹腔注射）治疗。
4.6 Y迷宫测试
用于评估小鼠短期记忆能力。记录小鼠在5分钟内的自发交替行为，计算交替百分比。
4.7 旷场测试
用于评估小鼠焦虑样行为。记录小鼠在5分钟内的中央区域停留时间、总移动距离和进入中央区域次数。
4.8 新物体识别测试
用于评估小鼠识别记忆。小鼠先探索两个相同物体，2小时后探索一个熟悉物体和一个新物体，计算新物体识别指数。
4.9 悬尾测试
用于评估小鼠抑郁样行为。将小鼠尾部悬吊6分钟，记录不动时间。
4.10 苏木精-伊红（H&E）染色
用于分析脑组织形态。对石蜡切片进行染色，在光学显微镜下观察。
4.11 尼氏染色
用于评估神经元损伤。对海马组织切片进行染色，计数标记细胞。
4.12 SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色
用于检测细胞衰老。使用商业染色检测试剂盒对组织切片进行染色。
4.13 细胞培养
人小胶质细胞系HMC3在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的MEM培养基中培养。细胞分为不同处理组。
4.14 免疫荧光染色
对细胞或脑组织冰冻切片进行固定、透化、封闭后，与一抗、二抗及DAPI孵育，在荧光显微镜下观察成像。
4.15 RNA提取与实时荧光定量PCR
使用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA后，使用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR分析，以GAPDH作为内参基因。
4.16 蛋白提取与Western blot分析
使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定浓度。进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，与一抗、二抗孵育，使用化学发光法显影，ImageJ软件分析条带光密度。
4.17 统计分析
临床研究数据使用R和Empower软件进行分析。动物和细胞实验数据使用GraphPad Prism软件进行分析。组间比较采用t检验、单因素或双因素方差分析。p < 0.05认为有统计学意义。
