1 引言
睾丸是负责精子发生和睾酮分泌的重要器官，其功能衰退与迟发性性腺功能减退症（LOH）密切相关。LOH是一种常见的与年龄相关的雄激素缺乏症，临床表现为骨质疏松、肌肉萎缩、抑郁状态、勃起功能障碍和精子发生受损等症状。尽管其临床意义重大，但LOH的分子机制尚不清楚。近期研究发现，LOH患者的支持细胞（Sertoli cells）表现出溶酶体酸化缺陷和病理性脂滴（LD）积累。然而，LD积累与支持细胞功能障碍之间的机制联系仍未解决。
脂滴是由中性脂质核心（ triacylglycerols and cholesteryl esters）和磷脂单层组成的细胞器。当脂滴在非脂肪组织中异常积累时，越来越多地被认为是细胞功能障碍的介质。在神经退行性疾病中，胶质细胞脂滴沉积会加剧神经元损伤，而减少脂滴可改善疾病进展。类似地，肾髓质脂滴积累驱动慢性肾脏病中的纤维化，肝脏脂肪变性伴脂滴超载是非酒精性脂肪肝的一个标志。从机制上讲，过多的脂滴通过压倒β-氧化能力来损害线粒体功能，导致有毒游离脂肪酸溢出、线粒体功能障碍和活性氧（ROS）过量产生。
蛋白质合成是细胞稳态的基石，在衰老过程中变得失调，全局翻译减弱导致器官功能障碍。核糖体碰撞是翻译应激的标志，由多种损伤引起，包括营养剥夺、mRNA结构异常和氧化损伤。碰撞的核糖体激活核糖体毒性应激反应（RSR），其中传感器激酶ZAKα磷酸化下游效应因子p38和JNK，触发适应性信号传导或持续应激下的凋亡级联反应。尽管ZAKα和下游p38的核糖体碰撞依赖性激活已在肝脏和皮肤中得到表征，但其在生殖系统中的存在和功能意义尚未被描述，这凸显了在睾丸衰老中研究这一通路的必要性。
2 结果
2.1 肥胖加剧体内睾丸衰老
为了研究睾丸衰老相关的变化并确定肥胖是否会加速睾丸衰老，研究人员建立了三种实验性小鼠模型：年轻对照组（2个月大，Y）、自然老年组（20个月大，NO）和肥胖老年组（20个月大伴有肥胖合并症，OO）。OO组与Y组和NO组相比，体重显著增加，同时睾丸与体重比显著降低。NO组和OO组的总血清睾酮水平相对于Y对照组显著降低，OO组下降最为严重。组织病理学分析显示，OO小鼠睾丸退化明显，表现为生精小管紊乱（HE染色）和过度胶原沉积（Masson染色），这些表型比NO小鼠更严重。此外，Y组的C/C评分（细胞数与管腔周长之比）最高，显著超过NO组和OO组，OO组最低。睾丸的免疫荧光染色进一步显示，与Y组相比，NO组和OO组的 Leydig 细胞（LCs）、支持细胞（SCs）和生殖细胞（GCs）数量显著减少。对三种实验模型（Y、NO、OO）中肌肉、肝脏和肾脏的组织病理学分析显示，NO组和OO组出现进行性组织退化，OO组退化更严重。值得注意的是，与Y睾丸相比，NO和OO睾丸表现出升高的衰老相关β-半乳糖苷酶活性，OO睾丸的支持细胞SA-β-gal活性最高，表明支持细胞衰老。由于支持细胞是血睾屏障的一个组成部分，研究人员检测了该屏障的组成部分ZO-1蛋白。ZO-1蛋白的荧光染色显示，与Y组小鼠相比，NO组和OO组小鼠的血睾屏障完整性受损，OO组受损最严重。此外，尼罗红和油红O染色显示，NO和OO睾丸中脂质积累加速，OO睾丸显示更明显的脂滴积累。那么，睾丸支持细胞中脂滴积累与睾丸衰老之间有什么联系？有报道称，大脑小胶质细胞中的脂滴积累会导致过量ROS产生，导致大脑衰老。因此，研究人员也检测了睾丸组织中的ROS，发现ROS水平呈现年龄相关性增加。与Y组和NO组相比，OO组的ROS水平显著更高。观察到的ROS水平增加广泛发生在睾丸组织内，影响支持细胞和生殖细胞。这些发现将脂质驱动的ROS定位为连接肥胖和睾丸衰老的纽带，合并症肥胖在体内作为年龄相关性性腺功能减退的代谢促进剂。
2.2 脂滴积累在体外触发支持细胞衰老
由于获取自然衰老的支持细胞进行机制研究存在挑战，迫切需要建立一种能够重现自然衰老支持细胞特征的体外模型。首先，研究人员采用两步酶消化程序分离支持细胞和 Leydig 细胞，最终纯度超过90%。然后，为了系统评估不同衰老模式下支持细胞的衰老表型，建立了六种不同的衰老模型：棕榈酸（PA）诱导的脂毒性、过氧化氢（H2 O2 ）介导的氧化应激、紫外线（UV）引发的DNA损伤、细胞碎片（Debris）驱动的代谢应激、通过连续传代引起的复制性衰老（Rep）和自然衰老（Aging，20个月大小鼠）。SA-β-gal染色显示，所有模型与对照组相比，SA-β-gal活性均显著增加。此外，免疫印迹分析也显示衰老相关标志物p53、p21和p16的表达上调。这表明所有这些建模方法都能诱导支持细胞衰老，但其潜在机制可能不同。因此，研究人员对这些衰老诱导的支持细胞进行了RNA测序，以确定哪种衰老模式的RNA转录与自然衰老最相似。转录组谱的主成分分析（PCA）显示，在三维多维空间（PC1/PC2/PC3）中，H2 O2 、Debris和PA组与自然衰老（Aging）组紧密聚集，表明这些衰老模型与生理衰老之间存在共享的分子特征。此外，Bray-Curtis相异性和Jaccard指数表明，Aging组和PA组之间的重叠度显著高于H2 O2 模型，暗示脂质积累诱导的衰老和自然衰老之间存在保守的通路激活。通过油红O染色评估的脂质积累在PA处理和自然衰老的支持细胞中显著升高，表明脂质积累是生理衰老的核心驱动因素。虽然H2 O2 导致支持细胞衰老，但它不会导致脂滴积累。相反，PA组诱导细胞衰老和脂滴积累，与衰老组相似。这些结果表明，脂滴驱动的衰老是自然衰老的可靠体外模型，共享保守的转录网络和功能衰退。因此，后续研究将使用PA组代替自然衰老组。
2.3 支持细胞中的脂滴损害线粒体，导致ROS产生和睾丸衰老
体内研究表明，衰老的支持细胞表现出显著升高的活性氧（ROS）水平，确定ROS是衰老的主要致病因素。鉴于线粒体是细胞内ROS的主要来源，研究人员量化了线粒体ROS（Mitosox）水平，结果显示老年睾丸组织、衰老的支持细胞和PA诱导的衰老模型中的Mitosox荧光显著增加。通过透射电子显微镜（TEM）进行的超微结构检查显示，与Y组相比，NO组和OO组睾丸组织支持细胞出现线粒体肿胀，表明存在线粒体功能障碍。此外，TEM还揭示了体外衰老和PA处理的支持细胞中的超微结构异常，包括线粒体肿胀和嵴结构紊乱。同时，衰老的睾丸表现出线粒体编码蛋白ND6和细胞色素c氧化酶亚基I（COX I）的进行性下降，以及细胞色素c（Cyto C）水平降低，OO组抑制程度最大。JC-1染色显示，与对照组相比，衰老组和PA处理组的线粒体膜去极化，而ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）共处理部分恢复了线粒体膜去极化。PA处理显著降低了OCR和最大呼吸能力，表明线粒体功能障碍。NAC共处理部分恢复了OCR，表明其对PA诱导的线粒体损伤具有保护作用。PA处理还显著增加了SA-β-gal阳性细胞，而NAC共处理减弱了PA引发的细胞衰老。此外，PA通过减少EdU阳性细胞的百分比显著降低了细胞增殖，而NAC共处理逆转了这种抑制并恢复了增殖能力。PA处理还显著损害了支持细胞的吞噬活性，表现为与对照组相比，酵母聚糖颗粒摄取减少，而NAC共处理部分逆转了PA诱导的吞噬抑制。研究人员还通过将 Leydig 细胞与来自不同处理的支持细胞的条件培养基共培养，研究了支持细胞衰老对 Leydig 细胞功能的影响。结果表明，来自衰老支持细胞的条件培养基损害了 Leydig 细胞的睾酮分泌并促进了其衰老。然而，NAC处理减少了这些不利影响。PA还通过增加通透性破坏了血睾屏障完整性，如FITC-葡聚糖荧光强度升高所示。NAC处理显著降低了PA诱导的通透性增加，表明其在恢复屏障功能方面具有保护作用。这些发现共同确立了线粒体损伤诱导的ROS是睾丸衰老的主要协调者，驱动支持细胞衰老及其功能障碍，而ROS清除剂NAC可以部分逆转这一过程。
2.4 ROS因核糖体碰撞导致蛋白质合成全局性下降
为了进一步探索ROS诱导支持细胞衰老的机制，研究人员从老年和年轻小鼠中获取原代支持细胞并进行RNA测序。火山图揭示了衰老组和对照组之间的显著差异基因表达，标记有大量上调（粉色）和下调（蓝色）基因。GO富集分析确定了与衰老相关的生物过程，其中细胞质翻译作为一个显著富集的过程出现，其次是线粒体呼吸链组装和氧化磷酸化，共同反映了与衰老相关的关键转录改变。细胞质翻译在衰老中显著下调，负富集分数（NES: -2.81）和高统计显著性（p值 < 0.001），表明衰老支持细胞中的翻译活性降低。在RNA-seq发现翻译机制下调的指导下，研究人员接下来试图确定这些转录组变化是否导致了蛋白质合成的功能缺陷。为了实验验证生物信息学结果，进行了多核糖体分析和使用嘌呤霉素的免疫印迹分析。多核糖体分析和免疫印迹分析表明，衰老和PA处理的支持细胞翻译活性降低，表现为多核糖体/单核糖体比率降低和Puro/ACTB表达水平降低。根据Simon的研究，H2 O2 诱导的ROS在U2OS细胞中可引起核糖体碰撞，随后激活ZAKα蛋白。因此，研究人员推测睾丸衰老支持细胞中蛋白质合成的下降是否同样由核糖体碰撞引起。因此，进行了ROS检测，发现PA处理的支持细胞显著增加了线粒体ROS，而NAC有效清除了线粒体ROS。PA处理损害了翻译活性，而NAC共处理部分逆转了这些效应，表明ROS导致了PA诱导的翻译抑制，NAC通过抗氧化活性减轻了这种损伤。此外，多核糖体分析结果显示，PA处理与对照组相比增加了二聚体峰，表明PA确实可以在支持细胞中诱导核糖体碰撞。而且，核糖体碰撞发生在衰老和PA处理的支持细胞中，表现为ZAKα和p-p38水平增加。这些增加被NAC共处理减弱，表明清除ROS减少了核糖体碰撞的发生。这些发现确立了ROS是支持细胞中核糖体碰撞的驱动因素，激活ZAKα-p38信号以抑制全局翻译并加速衰老。抗氧化干预（NAC）减轻了碰撞负担，凸显了ROS清除作为保护翻译活性和细胞稳态的潜在策略。
2.5 ROS诱导核糖体停滞和碰撞以破坏mRNA翻译
为了阐明ROS积累与衰老过程中翻译失调之间的分子机制，研究人员接下来进行了单核糖体足迹分析（Ribo-seq）和二聚体足迹分析（Disome-seq），以全面分析ROS对mRNA翻译的影响。值得注意的是，与mRNA水平相比，翻译效率发生了显著更大的变化。单核糖体测序数据显示，与对照细胞相比，PA处理的支持细胞中有420个基因的翻译效率显著增加，而648个基因的翻译效率显著降低。此外，与对照组相比，PA处理的支持细胞中翻译起始显著减少。密码子占据分析进一步证明，在终止密码子处的核糖体频率增加，在起始密码子处的核糖体频率减少。总的来说，这些结果与上述发现一致，即ROS强烈抑制mRNA翻译。随后，进行了Gene Ontology分析以对mRNA翻译变化进行分类。结果显示，翻译效率增加的基因主要与氧化应激反应和脂质代谢相关。相反，翻译效率降低的基因主要与衰老相关通路有关，例如端粒维持、DNA损伤反应和细胞周期调控。与衰老过程一致，PA处理的细胞显示出SIRT5、Irf7、Plk1和Chek1 mRNA的翻译效率严重抑制，这些基因已知直接或间接参与衰老。有趣的是，研究人员观察到这些转录本在PA处理的细胞中出现显著的翻译停滞，同时通过Disome-seq在同一位置检测到明显的碰撞。更重要的是，使用Pausepred，研究人员检测到与对照组相比，PA处理组的核糖体暂停显著增加，在PA组中识别出146,800个高置信度暂停位点（覆盖率 > 5%，暂停分数 > 10），而对照组为110,647个位点。在预测的暂停位点中，PA组的1731个候选位点的暂停分数发生了显著变化，与对照比对中的相应位置相比至少相差50分。重要的是，容易发生这种翻译暂停的基因主要与衰老过程相关。此外，1537个暂停位点位于编码序列（CDS）区域内，A位点的主要暂停密码子是GAC（天冬氨酸/D）、GAA（谷氨酸/E）、GAG（谷氨酸/E）和GAU（天冬氨酸/D）。为了研究影响年龄依赖性核糖体暂停的潜在调控基序，研究人员检查了1731个候选序列中检测到的暂停位点周围25个核苷酸。使用Multiple EM for Motif Elicitation (MEME)，研究人员在这些序列的662个位点中鉴定出一个高度显著的富含GA的基序。值得注意的是，某些氨基酸的位置存在显著富集，天冬氨酸和谷氨酸在多个核糖体暂停位点周围富集。这些数据共同为ROS在诱导核糖体停滞和碰撞，导致mRNA翻译破坏，特别是在编码天冬氨酸和谷氨酸的富含GA序列处的作用提供了进一步的支持。
2.6 ZAKα敲低减弱PA诱导的支持细胞衰老和功能损伤
为了研究ZAKα在衰老相关表型中的功能作用，研究人员首先使用三个独立的shRNA构建体（shZAKα-1, shZAKα-2, shZAKα-3）验证了其在支持细胞中的敲低效率。RT-qPCR和免疫印迹分析证实了ZAKα的mRNA和蛋白水平均显著降低，其中shZAKα-1表现出最高的沉默效力。从机制上讲，核糖体碰撞激活ZAKα介导的p-p38信号，触发TP53/NF-κB通路，通过p21依赖性细胞周期停滞和SASP相关的IL-6产生驱动衰老。PA处理增加了ZAKα表达和p38磷酸化，这些效应被ZAKα敲低显著降低。在功能上，PA诱导的翻译抑制、SASP基因上调（IL-1α, IL-6, TGF-β, CXCL1）、衰老（SA-β-gal+细胞增加）和细胞周期停滞（EdU+细胞减少）均被ZAKα敲低显著减弱。研究人员还研究了支持细胞衰老对 Leydig 细胞功能的影响。结果表明，来自衰老支持细胞的条件培养基损害了 Leydig 细胞的睾酮分泌并促进了其衰老。然而，shZAKα-1转染减少了这些不利影响。PA处理损害了吞噬功能，而shZAKα-1转染部分恢复了吞噬活性，突出了ZAKα在介导PA诱导的吞噬功能障碍中的关键作用。此外，与shCtrl组相比，PA处理还显著增加了下室培养液中的FITC-葡聚糖浓度，表明细胞间连接减弱。然而，在PA处理的支持细胞中转染shZAKα-1降低了下室培养液中的FITC-葡聚糖浓度。此外，与shZAKα-1的结果一致，敲低shZAKα-2或shZAKα-3也减轻了PA诱导的支持细胞衰老。这些数据共同确立了ZAKα是PA诱导的支持细胞衰老的核心介质，协调核糖体碰撞信号以损害翻译、放大SASP并破坏关键的生理功能。靶向ZAKα可能代表一种对抗脂质应激驱动的睾丸功能障碍的治疗策略。
2.7 ZAKα抑制剂尼洛替尼改善老年小鼠睾丸
为了研究ZAKα抑制剂尼洛替尼在体外的作用，研究人员首先用PA处理支持细胞，观察到与对照组相比，ZAKα表达和p-p38磷酸化显著上调。与ZAKα抑制剂尼洛替尼共处理减弱了这些效应。PA处理显著增加了SA-β-gal+支持细胞的比例，而尼洛替尼逆转了这一现象。此外，PA损害了细胞增殖（表现为EdU+细胞减少）并抑制了翻译活性（表现为Puro/ACTB比率降低）。这两种表型均被尼洛替尼部分挽救。PA还诱导线粒体功能障碍，而尼洛替尼共处理恢复了线粒体功能。这些数据表明尼洛替尼在体外改善了支持细胞衰老。为了评估这些发现在体内的生理相关性，研究人员对20个月大的小鼠每隔一天腹腔注射尼洛替尼（10 mg/kg），持续8周。对老年（NO组）和尼洛替尼处理的老年（Nilo组）小鼠进行了生理评估。值得注意的是，与年轻（Y组）对照组相比，NO组小鼠的睾丸与体重比降低，而尼洛替尼治疗恢复了这个比率。通过嗅探和爬跨测试评估的性行为在NO小鼠中受损，但在Nilo组中部分恢复。转棒测试结果显示，与Y组相比，NO组的潜伏期显著缩短，表明老年小鼠运动功能受损。尼洛替尼治疗显示出改善潜伏期的趋势，尽管差异无统计学意义。与Y组相比，NO组的血清和睾丸内睾酮水平显著降低，而尼洛替尼治疗部分恢复了睾酮水平。与Y组相比，NO组睾丸的SA-β-gal染色增加，表明细胞衰老加剧，尼洛替尼治疗减弱了这种衰老。类似地，与Y组相比，NO组的线粒体ROS水平升高，而尼洛替尼给药显著降低了ROS。值得注意的是，尼洛替尼保留了睾丸细胞组成，挽救了在老年小鼠中减少的DDX4+生殖细胞、SOX9+支持细胞和CYP11A1+ Leydig 细胞群体。组织学分析揭示了NO组睾丸、肾脏、肝脏和肌肉中与年龄相关的病理变化，包括空泡化和结构紊乱。这些异常被尼洛替尼改善。通过TEM进行的超微结构分析显示，NO组支持细胞出现线粒体肿胀，尼洛替尼缓解了这种情况。与Y组相比，NO组睾丸组织支持细胞中的脂质沉积增加，而尼洛替尼治疗减轻了这种与年龄相关的脂质积累。细胞周期相关蛋白（p53和p21）、ZAKα和p-p38在衰老睾丸中升高，但被尼洛替尼降低。此外，SASP因子（IL-1α, IL-6, TGF-β, CXCL1）的表达在Nilo组睾丸中同样受到抑制。这些发现共同证明，通过尼洛替尼药理抑制ZAKα可减轻老年小鼠的多种衰老特征，包括细胞衰老、线粒体功能障碍和组织退化。
3 讨论
本研究确立了脂滴（LD）驱动的线粒体ROS是支持细胞衰老和睾丸衰老的关键机制，揭示了一个涉及生殖系统中核糖体碰撞和ZAKα激活的先前未被认识的轴。这些发现与新兴证据一致，即代谢性脂滴超载会破坏衰老组织（如大脑、肝脏、心脏和肾脏）的器官功能。LOH患者和PA处理模型中支持细胞中LD的积累反映了神经退行性和肝脏疾病中的观察结果，其中脂质过氧化和线粒体ROS放大了细胞功能障碍。然而，我们的工作将LD相关的氧化应激与生殖衰老背景下的核糖体毒性信号联系起来，扩展了氧化还原生物学 beyond 经典的DNA或蛋白质损伤范式。
这一机制的核心是LD超载引发的线粒体完整性崩溃。支持细胞负责维持高能量的精子发生，严重依赖氧化磷酸化，使它们容易受到脂质诱导的电子传递链（ETC）破坏的影响。RNA-seq揭示的线粒体复合物亚基和翻译机制的下调表明，ROS过量产生耗尽了细胞维持蛋白质稳态的能力——这一现象先前在神经元中有记载。值得注意的是，我们证明来自受损线粒体的ROS直接引起核糖体碰撞，这是生殖生物学中的一个新发现。核糖体碰撞通常与翻译延伸错误或营养剥夺相关，越来越被认为是通用的应激传感器。我们的数据将这一概念扩展到脂质诱导的氧化还原应激，其中ROS扰乱核糖体功能，创建一个核糖体毒性信号的自放大循环。
ZAKα的激活是这一级联反应中的关键检查点。ZAKα在将碰撞信号传递给p38通路中的作用已在病毒感染和UVB诱导的损伤中得到表征，但其在衰老相关衰老中的作用尚未被探索。我们观察到ZAKα抑制可挽救支持细胞功能，强调了其作为氧化还原代谢失衡的传感器和效应器的双重作用。这与最近的研究一致，表明ZAKα消融可延长寿命并减轻肝纤维化，暗示其促衰老功能的进化保守性。重要的是，在ZAKα阻断后衰老表型的可逆性突出了睾丸衰老中氧化还原-蛋白质稳态失调的动态性质，挑战了衰老作为不可逆终点的观念。
虽然我们的发现阐明了老年支持细胞中LD-ROS-核糖体碰撞轴，但仍有几个问题有待解决。首先，线粒体ROS和核糖体停滞之间的精确分子联系需要进一步研究。ROS可能氧化rRNA或核糖体蛋白，正如神经退行性模型中所暗示的，或者通过氧化损伤耗尽tRNA库——这一假设得到了我们RNA-seq数据中核糖体生物发生基因下调的支持。其次，支持细胞中ZAKα与其他氧化还原敏感通路之间的串扰仍有待绘制。最后，虽然我们的PA模型重现了人类LOH的关键特征，但与年龄相关的睾丸衰老可能涉及来自多种脂质和 炎 症 介 质 的
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