摘要
铁死亡的治疗性激活是诱导癌细胞死亡的一种潜在策略。解读铁死亡的表观遗传调控可能为增强癌细胞铁死亡的有效方法提供见解。本研究首次鉴定出CRB2作为头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中铁死亡的表观遗传调节剂。CRB2的表达与铁死亡相关基因的表达相关，并与HNSCC患者的良好预后相关。铁死亡诱导剂erastin和RSL3显著增加CRB2表达，而过表达CRB2使HNSCC对铁死亡敏感，在体外和体内抑制生长。CRB2上调导致铁死亡抑制剂SLC7A11启动子区域的组蛋白H4第20位赖氨酸二甲基化（H4K20me2）增加，从而表观遗传地抑制其转录并诱导HNSCC铁死亡。机制上，CRB2阻碍组蛋白赖氨酸去甲基化酶LSD1的E8A亚型（LSD1(E8A)）与去泛素化酶USP7之间的相互作用，从而促进LSD1(E8A)的降解，随后增加H4K20me2水平。这些结果表明CRB2通过激活表观遗传轴刺激铁死亡，提示CRB2的上调是HNSCC的潜在治疗策略。
引言
头颈部肿瘤是常见的上呼吸道肿瘤，与烟草和酒精的过度消费密切相关；约90%的病例病理诊断为头颈鳞状细胞癌（HNSCC）。尽管以手术为主的疗法结合放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗持续改进，但HNSCC患者的5年生存率仍然停滞不前。因此，鉴定监测癌症进展和预后的新分子，并确定潜在靶点以探索有价值的治疗策略，对于进一步提高HNSCC患者的临床疗效迫在眉睫。
铁死亡作为一种新型的非凋亡调节性细胞死亡，由铁依赖性脂质过氧化产物和致死性活性氧（ROS）的过度积累驱动。铁死亡的特征是典型的形态学变化，如线粒体变小、嵴减少、线粒体膜密度增加和外膜破裂。肿瘤抑制因子、癌基因及其下游信号通路的扰动介导铁死亡，有助于多种病理过程，包括肿瘤生物学和癌症治疗。铁死亡的发生涉及铁死亡诱导与其防御系统之间的失衡，这些系统包括二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）-泛醇（CoQH2）系统、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）-还原型谷胱甘肽（GSH）系统、铁死亡抑制蛋白1（FSP1）-CoQH2系统和GTP环水解酶1-四氢生物蝶呤系统。在某些情况下，癌细胞依赖铁死亡在化疗、放疗和免疫治疗等治疗条件下生存。由于这些治疗在晚期HNSCC患者中的重要性，靶向铁死亡可能为对这些常规疗法难治的HNSCC患者提供潜在的治疗机会。
表观遗传学通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的作用机制修饰基因表达，而不是改变DNA序列。DNMT1介导的CDO1高甲基化抑制子宫内膜癌中的铁死亡，而DNMT1对GPX4启动子的高甲基化加剧骨质疏松症中的成骨细胞铁死亡。作为一种关键的基因调控机制，表观遗传修饰在铁死亡中的确切作用尚不清楚。解读铁死亡的表观遗传调控为药物开发，尤其是抗癌药物，铺平了道路。
本研究发现，CRB2通过阻碍LSD1(E8A)与USP7的相互作用，抑制LSD1(E8A)的稳定性和去甲基化酶活性，导致SLC7A11（也称为xCT）启动子区域内组蛋白H4第20位赖氨酸二甲基化（H4K20me2）升高，从而抑制SLC7A11-GPX4信号通路并最终诱导铁死亡。这些结果表明CRB2在铁死亡诱导中起关键作用，突出了其在HNSCC治疗中的潜力。
材料与方法
生物信息学分析
从PathCards网站获取39个铁死亡核心基因。从UCSC Xena下载HNSCC（TCGA）的基因表达数据和患者生存数据（n = 499）。使用39个铁死亡核心基因作为输入进行基因集变异分析（GSVA），获得铁死亡核心指数（FCI）。对FCI低与FCI高患者的mRNA表达数据进行分析，并通过Venn方法与表观遗传数据相交。使用Kaplan-Meier方法进行预后分析，并使用对数秩检验进行评估。
细胞培养
使用多个人HNSCC细胞系（Tu686, HN8, JHU011, SCC17B, Fadu, SCC4）和人口腔黏膜癌前病变细胞系DOK以及人胚胎肾HEK293T细胞。细胞在含10% FBS和抗生素的相应培养基中于37°C、5% CO2培养。所有细胞系均排除支原体污染，并在解冻后15代内使用。
抗体和化学品
使用列于补充表中的抗体。铁死亡诱导剂（erastin, RSL3, IKE）和抑制剂（Fer-1）等化学品购自Selleck Chemicals。
实时定量PCR（qRT-PCR）分析
使用TRIzol试剂提取总RNA，反转录合成cDNA，使用SYBR Green Master Mix在ABI 7500HT系统上进行实时PCR。使用2−ΔΔCT方法量化基因表达，以β-肌动蛋白表达为内参。
蛋白质印迹（Western Blotting）和免疫共沉淀（IP）
总蛋白通过SDS-PAGE分离，转膜后与一抗孵育，再与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。使用β-肌动蛋白、GAPDH或α-微管蛋白作为内参。对于IP，细胞裂解液与指定抗体和蛋白G珠或标签磁珠孵育过夜，洗脱后通过Western Blot或LC/MS-MS分析。
基因转染
使用慢病毒系统生成稳定过表达CRB2和敲低CRB2或LSD1的HNSCC细胞系。使用siRNA进行CRB2的瞬时敲低。转染效率通过Western Blotting评估。
细胞活力测定
使用CCK8试剂盒评估细胞在不同药物处理72小时后的活力。
脂质ROS测定
使用BODIPY 581/591 C11探针通过流式细胞术检测脂质过氧化水平。
胱氨酸摄取测定
通过检测细胞内GSH水平来评估胱氨酸摄取，使用总GSH测定试剂盒。
透射电子显微镜（TEM）
用于分析线粒体的超微结构。细胞经固定、脱水、包埋后制备超薄切片，染色后观察。
结构光照明显微镜（SIM）
用罗丹明123染色线粒体，使用SIM捕获图像。
免疫荧光显微镜分析
细胞固定、透化、封闭后与一抗和二抗孵育，DAPI染色后通过荧光显微镜观察。
染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR和测序
使用ChIP试剂盒进行实验。染色质经消化和超声处理后与抗体孵育，富集的DNA片段通过qPCR或ChIP-seq进行分析。
荧光素酶报告基因检测
将SLC7A11启动子报告质粒转染入细胞，检测荧光素酶活性以评估启动子转录活性。
异种移植肿瘤模型
将Fadu细胞皮下注射到裸鼠右腋窝，待肿瘤体积达到约80 mm3时，随机分组并用IKE处理。监测肿瘤体积和小鼠状态。
患者样本和信息收集
从2000年1月至2005年10月在我科接受手术的114名HNSCC患者中获取样本。前瞻性收集2025年3月至4月间27名患者的新鲜组织样本用于分子分析。研究经伦理委员会批准。
免疫组织化学（IHC）和染色评估
使用二步法检测试剂盒进行IHC染色。通过染色强度（1+-4+）和染色范围（0-4）计算染色评分（SI），将蛋白表达分为低表达（SI = 0–5）和高表达（SI = 6–12）。
统计分析
定量数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism进行统计分析和作图。使用双尾Student t检验、Wilcoxon秩和检验、双向ANOVA或χ2分析。使用单变量和多变量Cox回归分析独立预后因素。P < 0.05被认为具有统计学显著性。
结果
生物信息学鉴定CRB2为铁死亡的潜在表观遗传修饰因子
通过生物信息学分析策略，将HNSCC样本分为FCI高和低两组。FCI高的患者总生存率更好。差异表达基因与表观遗传基因相交后，鉴定出19个表观遗传调节因子。其中10个基因在肿瘤与癌旁组织中存在差异表达。Kaplan-Meier分析确定ZBTB7C、SATB1、SCML4和CRB2这4个基因的高表达预示HNSCC患者更好的预后。用铁死亡诱导剂处理HNSCC细胞后，qPCR和Western Blotting显示erastin和RSL3显著上调CRB2的mRNA和蛋白水平，而其他三个基因变化不一致或不显著。因此，研究聚焦于CRB2。
CRB2促进铁死亡并抑制HNSCC生长
CRB2在各种HNSCC细胞系中表达水平不同。在CRB2蛋白水平最低的Fadu细胞中过表达CRB2，增强了其对erastin诱导的铁死亡的敏感性，呈剂量依赖性。平板克隆形成实验显示CRB2可抑制细胞活力。CRB2驱动的表型可被铁死亡抑制剂Fer-1显著阻断，但不受凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）和自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤）影响。流式细胞术检测显示CRB2过表达显著提高了erastin触发的脂质过氧化水平，细胞内GSH/GSSG水平下降。TEM和SIM分析证实CRB2过表达的Fadu细胞表现出铁死亡典型的线粒体形态变化。在体内异种移植模型中，CRB2过表达和铁死亡诱导剂IKE均能抑制Fadu细胞生长，且CRB2过表达显著提高了IKE的抗肿瘤效率。这些结果表明CRB2在体外和体内诱导HNSCC铁死亡并抑制肿瘤生长。
CRB2通过抑制SLC7A11-GPX4通路诱导铁死亡
对CRB2过表达的Fadu细胞进行转录组测序，获得623个差异表达基因（DEG），与铁死亡数据库中的259个基因相交，鉴定出20个潜在的下游靶点。GO和KEGG富集分析揭示了CRB2调控的生物学过程和通路。在排名前5的DEG中，qPCR证实只有SLC7A11在CRB2过表达的两种HNSCC细胞系中显著下调。Western Blotting和体内异种移植瘤实验进一步验证CRB2导致SLC7A11蛋白水平显著下调，而对FSP1或DHODH蛋白影响不显著。这些数据表明CRB2可能特异性抑制SLC7A11-GPX4信号通路，从而促进HNSCC铁死亡。
CRB2在SLC7A11启动子区域富集H4K20me2
研究发现CRB2增加了HNSCC细胞和异种移植瘤中H4K20me2的水平，而不是H4K20me1或H4K20me3。CRB2敲低则降低了H4K20me2水平，并伴随SLC7A11和GPX4的上调。ChIP-seq分析显示，CRB2调控的H4K20me2结合的DNA片段定位于启动子区域，并包含铁死亡相关基因SLC7A11。ChIP-qPCR证实H4K20me2确实与SLC7A11的启动子区域结合，且这种结合在CRB2过表达的HNSCC细胞中更为明显，而H4K20me1和H4K20me3未受影响。这种表观遗传启动子调控未在GPX4的启动子区域观察到。荧光素酶报告基因实验证明CRB2过表达确实抑制了SLC7A11的转录活性。这些数据提示CRB2通过增加H4K20me2，表观遗传地沉默SLC7A11表达，而非GPX4。
CRB2通过抑制LSD1(E8A)提升H4K20me2水平
qPCR显示CRB2并未显著且一致地改变H4K20me2相关mRNA水平。蛋白质质谱分析确定CRB2与两种组蛋白去甲基化酶LSD1（KDM1A）和RAD23B（HR23B）相互作用。CRB2的强制表达下调了LSD1，而非RAD23B。LSD1主要去甲基化H3K4和H3K9，而其去甲基化H4K20仅由神经元特异性亚型LSD1(E8A)调节。研究验证了LSD1(E8A)在多种HNSCC细胞系和癌症标本中的表达。ChIP-seq显示过表达LSD1(E8A)降低了3809个靶基因上的H4K20me2活性。在CRB2过表达的细胞中表达LSD1(非E8A)和LSD1(E8A)，发现只有LSD1(E8A)过表达能特异性抑制CRB2介导的H4K20me2上调。虽然LSD1(E8A)和LSD1(非E8A)均能抑制CRB2诱导的铁死亡敏感性变化，但LSD1(E8A)表现出更强的抑制作用。这表明CRB2通过抑制去甲基化酶亚型LSD1(E8A)而非LSD1(非E8A)来提升H4K20me2。
CRB2通过抑制其与USP7的相互作用增加LSD1(E8A)降解
CRB2加速了用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理的细胞中LSD1(E8A)的蛋白降解。用蛋白酶体抑制剂MG132处理时，在CRB2过表达细胞中观察到LSD1(E8A)蛋白增加。此外，CRB2导致Fadu细胞中LSD1(E8A)的泛素化增加，而在CRB2抑制的Tu686细胞中则相反。IP实验验证了LSD1(E8A)确实与CRB2在HNSCC细胞中相互作用。共聚焦荧光显微镜观察到LSD1(E8A)与CRB2在细胞质和细胞核中共定位。内源性表达的LSD1也观察到类似的蛋白稳定性和亚细胞共定位调控模式。蛋白质质谱分析发现CRB2仅与去泛素化酶USP7相互作用。CRB2削弱了USP7与LSD1(E8A)的结合能力。相反，当CRB2被敲低时，这种结合能力增强。相应地，USP7的过表达逆转了由CRB2引起的对铁死亡诱导剂敏感性的降低。总之，CRB2阻碍去泛素化酶USP7与LSD1(E8A)之间的相互作用，从而促进亚型蛋白LSD1(E8A)的降解，这有助于H4K20me2的升高。
CRB2过表达与HNSCC良好预后相关
TCGA-HNSCC数据和新收集的HNSCC样本均显示，与正常黏膜相比，癌样本中CRB2显著降低。通过IHC检测HNSCC样本中CRB2、H4K20me2和SLC7A11的蛋白水平。Kaplan-Meier图显示CRB2高表达患者总预后良好。单变量和多变量Cox回归分析均证实CRB2是HNSCC患者的独立生存保护因子。CRB2蛋白表达评分与H4K20me2呈正相关，与SLC7A11呈负相关。这些数据揭示了CRB2-H4K20me2-SLC7A11在HNSCC中的临床相关性。
讨论
本研究证明CRB2通过在体外和体内抑制SLC7A11-GPX4信号通路促进HNSCC铁死亡。机制上，CRB2阻碍LSD1(E8A)亚型与去泛素化酶USP7的相互作用， destabilizes 并加速LSD1(E8A)的蛋白降解，最终导致H4K20me2在SLC7A11启动子区域的特异性富集。因此，CRB2表观遗传地抑制SLC7A11的转录并促进HNSCC铁死亡。
作为氧化还原稳态的关键门户，SLC7A11维持GSH水平以对抗细胞氧化应激并抑制铁死亡。先前研究揭示了多种组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶在不同生理病理条件下表观遗传调控SLC7A11。本研究首次确定CRB2以特定的H4K20me2介导的表观遗传调控方式关闭SLC7A11的转录。研究还排除了CRB2不影响DHODH和FSP1水平的可能性。
CRB2作为Crumbs细胞极性复合体的蛋白质组分，与不同蛋白质相互作用并参与多种细胞过程。与胶质母细胞瘤中CRB2过表达预示不良临床结局不同，本研究显示CRB2作为肿瘤抑制因子，通过促进铁死亡抑制肿瘤生长，其过表达与HNSCC患者良好预后紧密相关。因此，CRB2对恶性行为的影响可能是癌症类型特异性的。
在HNSCC细胞系中，尽管CRB2表达水平相当，但对铁死亡诱导剂的药理学反应性存在差异，这强化了CRB2-铁死亡轴的关联，并提出CRB2增强作为一种合理的治疗策略。有趣的是，铁死亡诱导上调CRB2表达，而CRB2也促进铁死亡，表明HNSCC中存在潜在的调控回路。虽然铁死亡相关的脂质过氧化产物增强了STAT4的转录活性，提示存在脂质ROS介导的前馈机制驱动CRB2表达，但这些数据揭示了STAT4与此调控电路的功能联系。
多项研究证实CRB2快速定位DNA损伤位点并与H4K20的甲基化状态相关。本研究揭示了CRB2如何增加H4K20甲基化。CRB2阻碍去泛素化酶USP7与LSD1(E8A)和LSD1的相互作用，导致蛋白泛素化水平升高。与先前报道一致，LSD1蛋白稳定性在乳腺癌和胶质母细胞瘤中受USP7调控。众所周知，LSD1是一种主要调控H3K4或H3K9位点的组蛋白去甲基化酶，它可能通过SLC7A11在肺癌中发挥促铁死亡作用，或在非癌症疾病中发挥抑制作用。然而，本研究揭示CRB2通过亚型蛋白LSD1(E8A)而非LSD1特异性提升H4K20me2，这是本研究的一个亮点。LSD
