DCN型NEDD8 E3连接酶：结构、生物学功能与小分子抑制剂
1. 引言
蛋白质泛素化是细胞内关键的翻译后修饰过程之一，它通过将蛋白质靶向至蛋白酶体进行降解，从而在维持细胞稳态中发挥重要作用。该过程由E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶组成的级联反应催化。在哺乳动物细胞中，至少存在8种泛素样蛋白（UBLs），其中NEDD8是研究最为深入的UBL之一。
NEDD8化是一种类似泛素化的过程，涉及自身的特异性酶类，包括E1 NEDD8激活酶（NAE）、E2 NEDD8结合酶和E3连接酶。目前，在哺乳动物细胞中已发现一个E1（NAE，由UBA3/APPBP1异二聚体组成）、两个E2（UBE2F和UBE2M/UBC12）以及十余个E3。NEDD8 E3连接酶主要分为两大类：一类是含有RING结构域的E3（如RBX1/2、MDM2、c-CBL等），另一类则是DCN（Defective in cullin neddylation）家族成员（DCN1-5）。DCN家族不含RING结构域，但能与RBX1/2协同促进cullin蛋白的neddylation。
在已报道的neddylation底物中，CRLs被认为是其主要的生理学底物。NEDD8与cullin蛋白C末端的赖氨酸残基结合，从而激活CRLs。CRLs是主要的E3泛素连接酶类别，调控着细胞内约20%的蛋白质降解。研究表明，整个neddylation级联反应在多种人类疾病中过度激活，例如慢性肝病、神经退行性疾病、心脏疾病，尤其是癌症。过度激活的neddylation酶加速了CRLs的修饰，导致CRLs底物（特别是肿瘤抑制因子）的异常降解。因此，靶向该通路中的酶（E1、E2、E3）有望成为治疗这些疾病，特别是癌症的潜在策略。
MLN4924（又名pevonedistat）是一种高效的抗肿瘤药物，于2009年被发现，是目前公认的高选择性NAE抑制剂。它能够完全阻断neddylation通路，导致CRLs失活和多种底物（尤其是肿瘤抑制因子）的积累，进而通过诱导细胞凋亡、自噬和衰老发挥显著的抗癌活性，目前正在进行约30项I/II/III期临床试验。然而，由于其广谱阻断neddylation的特性，MLN4924存在多种毒性，且部分癌细胞系因NAE组分UBA3突变而产生耐药性。因此，开发靶向下游蛋白（如DCN1-5）的特异性强效抑制剂具有重要意义。
2. DCN家族成员的蛋白质结构
与低等生物只含有一个DCN1基因不同，人类编码了五种不同的DCN分子（DCN1-5，也称为DCUN1D1-5或DCNL1-5）。它们拥有独特的N端结构域，但共享一个保守的C端Potentiating neddylation (PONY)结构域，该结构域对于体外和体内的cullin neddylation既是必要的也是充分的。
2.1. DCN家族成员的N端
根据N端序列的同源性，DCN家族成员可分为三个亚群：
- 1.
DCN1和DCN2在其N端拥有一个UBA样结构域，可结合泛素和泛素化蛋白，二者氨基酸序列相似度达80%。
- 2.
DCN4和DCN5在其N端拥有典型的核定位序列（NLS），二者序列相似度为65%。DCN5的N端Ser-41可在Toll样受体信号传导中被磷酸化。
- 3.
DCN3具有较长的N端区域，包含一个N端豆蔻酰化序列（MGXXXT）和一个无序二级结构（NORS）域，其脂质修饰使DCN3定位于质膜。
研究表明，DCN1的UBA结构域可被单泛素化，这一过程由泛素E3连接酶NEDD4-1催化，并能促进DCN1的核输出。此外，DCN1的UBA结构域还可结合多聚泛素链，从而抑制其neddylation活性，进而降低CRLs介导的泛素化。值得注意的是，UBA结构域作为DCN1功能的负调控因子，其突变会增强DCN1的生化和致癌活性。
2.2. DCN家族成员的PONY结构域
PONY结构域高度保守，主要由四个EF-hand样元件组成，其C端区域包含一个cullin结合表面，称为DAD patch。该结构域直接与cullin蛋白的翼状螺旋亚结构域（WHB）以及NEDD8 E2（UBC12或UBE2F）结合，是催化neddylation的关键。
所有DCN PONY结构域均能与所有类型的cullin蛋白（cullin1-5）结合，但亲和力略有不同。这种亲和力差异主要取决于cullin蛋白的身份，而非DCN家族成员。此外，DCN PONY结构域也能直接与N端乙酰化的E2（UBC12或UBE2F）结合。其中，DCN1和DCN2的PONY结构域与乙酰化UBC12肽段的结合亲和力最高（Kd约为2 μM）。DCN3的PONY结构域则对乙酰化的UBE2F表现出最高的亲和力（Kd约为1.1 μM）。
2.3. DCNs与E2及cullin-RBX1/2复合物协同增强neddylation
DCNs作为支架型NEDD8 E3连接酶，可直接结合NEDD8 E2和cullin底物，促进NEDD8的转移。例如，DCN1主要通过以下方式增强neddylation：(i) 帮助将RBX1募集至cullin1，并与cullin1结合促进其核转位；(ii) 促进UBC12被招募至cullin1底物；(iii) 将NEDD8从UBC12转移至cullin1底物。
所有五种DCN PONY结构域均能刺激NEDD8从乙酰化UBC12转移到所有五种cullin C末端结构域（CTD）-RBX1复合物上。它们也能刺激NEDD8从乙酰化UBE2F的转移，例如与RBX1结合的cullin2 CTD以及与RBX1或RBX2结合的cullin5 CTD。然而，不同的DCN/cullin/NEDD8 E2组合在整体neddylation效率上存在显著差异，这通常与DCN非依赖性活性以及DCNP-cullin和DCNP-E2相互作用的亲和力相关。
3. DCN家族成员的生物学功能
3.1. DCN家族成员的亚细胞定位与表达谱
DCN家族成员在细胞内的定位存在部分重叠，但也具有独特的定位模式。DCN1和DCN2定位于细胞质和细胞核；DCN3通过其N端豆蔻酰化和棕榈酰化修饰定位于质膜；DCN4和DCN5则几乎完全位于细胞核内。这种亚细胞定位主要由其N端结构域调控，且不依赖于与cullin蛋白的相互作用。
在表达谱方面，DCN1是表达最广泛的亚型，在检测的所有小鼠组织中均有表达。DCN2主要在肝脏和肾脏中表达。DCN3的表达主要局限于睾丸和脑组织。DCN4在睾丸、心脏、脑、肾脏和肝脏中表达最强。DCN5的表达水平最低，仅在皮肤、睾丸和免疫组织（胸腺、脾脏、淋巴结）中低水平表达。
功能研究表明，敲低单个DCNs不会显著影响细胞中总体cullin的neddylation水平，但会影响某些cullin。例如，敲低DCN1会轻微降低所有cullin的neddylation，但对cullin1和cullin4A的影响更为明显；敲低DCN5也会影响cullin1和cullin4A的neddylation；敲低DCN4仅轻微影响cullin5和cullin4B的neddylation。有趣的是，敲低DCN3反而会增加cullin1、cullin3、cullin4A和cullin4B的neddylation，这表明DCN3可能具有抑制neddylation的作用。
3.2. DCN家族成员在人类疾病中的作用
DCN1-5已被确定为多种人类疾病的重要靶点，包括癌症、纤维化疾病、肝脏损伤、免疫和心血管疾病等。DCN1因其基因扩增和过表达与多种癌症（尤其是鳞状细胞癌）的进展密切相关而备受关注。
3.2.1. DCN1在癌症中的作用
DCN1在多种癌症中过表达，并调控着癌症的发生发展。在肺癌（特别是肺鳞状细胞癌，LUSC）中，DCN1的扩增与肿瘤的侵袭性、淋巴结转移和不良预后相关。DCN1能促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制涉及激活Hedgehog信号通路（上调Gli1）、上调血管内皮生长因子-A（VEGF-A）、激活黏着斑激酶（FAK）信号通路以及上调程序性死亡配体-1（PD-L1）等。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）、宫颈癌、结直肠癌和胶质瘤中，DCN1也表现出类似的促癌作用，其表达受到多种microRNA（如miR-195、miR-218、miR-302-3p、miR-520b、miR-3148）的负调控。
3.2.2. DCN1在非癌症疾病中的作用
除了癌症，DCN1在纤维化疾病中也扮演着关键角色。在肝纤维化、心脏纤维化和肾纤维化模型中，DCN1的表达均出现上调。靶向抑制DCN1（如使用小分子抑制剂HZX-960、NAcM-OPT、DN-2等）能够通过选择性抑制cullin3的neddylation，激活NRF2（NF-E2-related factor 2）抗氧化通路，从而减轻纤维化信号（如胶原蛋白I、α-SMA沉积）和炎症反应。
此外，DCN1还与神经退行性疾病和牙周炎相关。研究发现，DCN1基因的特定基因型（rs4859147 SNP的GG基因型）是额颞叶变性（FTLD）的一个风险因素。在牙周炎中，DCN1表达上调，其抑制可以下调炎症因子（如IL-6、TNF-α）的产生，并抑制NF-κB信号通路的激活。
4. 靶向DCN1的小分子抑制剂
鉴于DCN1在多种疾病中的关键作用，开发靶向DCN1的小分子抑制剂已成为一个有前景的治疗策略。目前已报道的DCN1抑制剂包括DI-591、NAcM-OPT、DC-2、WS-383、DI-1859、DN-2和HD2等。这些抑制剂大多通过模拟乙酰化UBC12的N端肽段，竞争性地结合DCN1 PONY结构域中的疏水口袋，从而阻断DCN1与UBC12的相互作用，抑制其neddylation活性。
5. 结论与展望
DCN型NEDD8 E3连接酶作为neddylation通路的关键调控因子，其结构和功能复杂多样。DCN1-5通过促进cullin蛋白的neddylation来调控CRLs活性，进而影响众多生理和病理过程。越来越多的证据表明，DCN1在多种癌症和纤维化疾病中异常表达，并促进疾病进展，使其成为极具吸引力的治疗靶点。尽管已开发出多种DCN1抑制剂，并显示出良好的治疗潜力，但仍需进一步研究DCN家族其他成员（DCN2-5）的生物学功能，以及探索更具选择性和高效性的抑制剂，以推动相关疾病的精准治疗。未来，深入理解DCNs在不同疾病背景下的特异性功能，以及发展针对特定DCN亚型的抑制剂，将是该领域的重要研究方向。
