引言
椎间盘（IVD）退行性病变（IVDD）是导致腰痛和腰椎活动受限的主要原因，也是目前最为普遍的脊柱退行性疾病，给社会带来了巨大的经济负担。IVDD的标志性特征是细胞外基质（ECM）的代谢失衡，表现为合成代谢减少和分解代谢增加，这导致了IVD内蛋白聚糖降解和水分含量降低。IVDD的发生发展是多因素病理过程共同作用的结果，包括衰老、过度机械负荷、肥胖、遗传因素和外伤等。其中，衰老是IVDD最主要的独立危险因素。然而，衰老诱导IVDD的精确发病机制仍未完全阐明。
此前有研究分析了年轻和老年健康捐赠者的血清样本，发现仅三种代谢物——磷酸烯醇式丙酮酸、喹啉酸和甲基丙二酸（MMA）——在老年捐赠者血清中持续升高。MMA是一种二羧酸，主要是丙酸代谢的副产物。值得注意的是，老年捐赠者的血清MMA浓度（范围：15–80 μM）显著高于年轻捐赠者（范围：0.1–1.5 μM）。随后的研究在大量参与者中也证实了这一点：血清MMA浓度较高的个体往往年龄更大。鉴于其与衰老的强相关性，MMA被认为是一种新型的衰老生物标志物。在生物系统中，MMA通过硫酯键与辅酶A结合形成甲基丙二酰-CoA，随后在甲基丙二酰-CoA变位酶（以维生素B12 为辅酶）的作用下异构化为琥珀酰-CoA，从而进入三羧酸（TCA）循环。目前，MMA的病理作用已在心血管疾病、肾脏疾病和肿瘤进展中被记录，并可能与活性氧生成和炎症通路激活有关。然而，在同样由退化、炎症和氧化应激驱动的IVDD中，MMA的作用仍存在关键的知识空白。
本研究的主要目的是鉴定和阐明与年龄相关的IVDD发病和进展的关键代谢物及关键分子调控机制，并最终制定有效的逆转和治疗策略。
结果
衰老是IVDD的关键驱动因素，MMA与衰老密切相关
本研究共纳入370名符合条件的个体。结果表明，年龄和BMI与IVDD显著相关，可能是IVDD的危险因素。单变量逻辑回归分析表明，年龄增加与进行性椎间盘退变的严重程度独立相关，IVDD分级随年龄增长而升高。
为了验证这些临床观察结果，研究者收集了3、12和18月龄C57BL/6小鼠的尾椎IVD标本。H&E染色显示了与年龄相关的进行性退行性改变。与年轻小鼠（3个月）相比，老年小鼠（18个月）的椎间盘表现出明显的形态学恶化。组织学评分证实，年龄与自然衰老模型中退化严重程度直接相关。SOFG和阿利新蓝（AB）染色进一步揭示了NP组织中胶原和蛋白聚糖/GAG含量随年龄增长而耗竭。免疫组化（IHC）分析显示了伴随年龄增长的分子变化，包括合成代谢ECM标志物II型胶原（COL2A）的进行性下调以及分解代谢酶基质金属蛋白酶3（MMP3）的同步上调。这些组织形态学和分子发现共同证实了IVDD的严重程度随着生物年龄增长而增加。
为了描绘IVD中年龄特异性的生化改变，研究者从三名年轻和三名老年患者的手术中随机收集了NP组织，并进行了广泛的靶向代谢组学分析。主成分分析显示年轻和老年的椎间盘之间存在显著的代谢分离。代谢分析表明，泛酸、肉碱-C12:1、烯酰胺、长链脂肪酸（18:1）和MMA是年轻和老年椎间盘之间差异较大的代谢物。考虑到MMA与年龄密切相关，研究者测量了MMA的绝对含量，发现其在老年组和年轻组之间存在显著差异；老年组IVD中的MMA含量是年轻组的1.5倍以上。
MMA和琥珀酸是结构异构体，但在代谢上不同。琥珀酸直接进入TCA循环，而MMA必须与辅酶A结合形成甲基丙二酰-CoA，然后在甲基丙二酰-CoA变位酶（维生素B12 是辅酶）作用下异构化为琥珀酰-CoA，再进入TCA循环。这种异构化步骤严格依赖于维生素B12 。因此，钴胺素缺乏会破坏甲基丙二酰-CoA代谢，导致MMA的病理性积累。对椎间盘组织钴胺素水平的定量显示，与年轻对照组相比，老年椎间盘中的维生素B12 浓度显著降低。这种与年龄相关的钴胺素消耗可能损害丙酸来源的MMA通过甲基丙二酰-CoA途径的转化，直接导致退变椎间盘内MMA水平升高。对失调代谢物的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，磷脂酶D信号、缺氧诱导因子（HIF）-1信号、血管内皮生长因子（VEGF）和炎症介质通路显著富集。这些发现暗示失调的HIF-1α信号、病理性血管生成和慢性炎症是年龄依赖性代谢改变（特别是MMA积累）驱动IVDD发病机制的关键效应机制。
MMA诱导IVDD
根据先前研究，5 mM MMA暴露48小时可达到与老年血清处理4小时相当的细胞内浓度。通过CCK-8测定评估了0–9 mmol/L MMA在48小时内对NP细胞活力的影响，最终选择5 mM用于后续实验。用0–5 mmol/L MMA处理NP细胞48小时的蛋白质印迹分析显示剂量依赖性的分解代谢转变；合成代谢标志物COL2A和聚集蛋白聚糖（ACAN）逐渐减少，而分解代谢酶MMP3和MMP13显著增加。这些结果证实了MMA在体外诱导退行性变化。β-半乳糖苷酶染色也显示浓度依赖性的细胞衰老增强。
为了在体内验证这些结果，研究者使用了小鼠尾椎间盘（Co3-Co6）穿刺模型，设置了三个实验组（假手术组、生理盐水注射组和5 mM MMA注射组）。影像学分析显示，与生理盐水组相比，MMA组的椎间盘高度指数（DHI）显著降低。对DHI和改良Pfirrmann退变分级的分析证实了通过穿刺和生理盐水注射成功诱导了IVD退变。此外，与生理盐水对照组相比，MMA给药显著加剧了退行性进展。与体外发现一致，对尾椎间盘标本的组织病理学评估显示MMA组出现严重退变，其特征是不规则的NP形态、NP面积显著减少、NP-AF边界模糊。该组也表现出最高的组织学退变评分。AB和SOFG染色揭示了NP组织内蛋白聚糖的大量耗竭。随后的IHC分析进一步验证了MMA处理的椎间盘中ACAN显著下调和MMP3同步上调，与体外实验结果完全一致。这些结果共同证实，MMA在体内外模型中都能有效加速IVDD。
MMA通过CCL7加速IVDD
对对照组和5 mM MMA处理组分离的NP进行的RNA测序鉴定出149个上调基因和67个下调基因。对前10位上调和下调基因的分析显示，CC趋化因子家族成员CCL2 CCL5 CCL7 CCL7 CCL7
MMA通过CCL7-JAK2/STAT3信号通路加速IVDD
KEGG通路分析揭示，黏着斑、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路和JAK2-STAT3通路在MMA诱导的IVDD中发挥重要作用。鉴于CCL7在激活CCR2后触发多种G蛋白介导的细胞内信号级联反应，如PI3K/AKT、MAPK和JAK/STAT3通路，研究者假设CCL7-JAK2/STAT3信号通路对MMA诱导的IVDD有重要贡献。对人类IVD组织的初步分析显示，老年组中磷酸化JAK2（pJAK2）和磷酸化STAT3（pSTAT3）表达显著升高，表明JAK2-STAT3通路在衰老相关IVDD中起关键作用。随后对用递增浓度MMA处理的NP细胞中pJAK2和pSTAT3水平的蛋白质印迹分析显示，两者均呈现明显的浓度依赖性增加。
为了确认JAK2-STAT3通路在MMA诱导的IVDD中的功能作用，研究者使用了Stattic，一种特定的STAT3磷酸化抑制剂，可抑制Y705和S727位点的磷酸化，从而使STAT3失活。通过CCK-8测定确定了用不同浓度Stattic处理24和48小时后的细胞活力，最终选择2.5 μM处理48小时用于后续实验。用5 mM MMA和Stattic处理NP细胞的蛋白质印迹验证证实了STAT3磷酸化的抑制。此外，与仅用MMA的组相比，Stattic共处理显著改善了合成代谢标志物（COL2和ACAN），减少了分解代谢标志物（MMP3和MMP13），并减轻了椎间盘退变，重申了JAK2-STAT3在IVDD中的关键作用。为了验证CCL7与JAK2/STAT3通路之间的关系，研究者在NP细胞中敲低了CCL7 CCL7
MMA通过CCL7-JAK2/STAT3-VEGF轴诱导IVD血管化和退变
基因本体（GO）分析表明，免疫反应、代谢过程和血管生成与MMA诱导的IVDD有关，而先前的代谢组学KEGG富集分析也涉及HIF-1和VEGF通路，暗示VEGF是椎间盘退变的关键介质。对人类NP组织的蛋白质印迹显示，老年与年轻椎间盘中VEGF蛋白水平显著升高。对MMA处理的NP细胞进行的蛋白质印迹分析发现，随着MMA浓度增加，VEGF的表达水平也上升。这一发现在小鼠尾椎间盘穿刺模型中得到再现，椎间盘标本的IHC显示，MMA处理组中VEGF和CD31表达显著升高，VEGF在AF和NP空泡区域大量积累，CD31阳性染色广泛存在。对另一组样本中VEGF和CD31的免疫荧光（IF）检查揭示了老年患者NP中VEGF和CD31的显著表达。此外，在老年患者的NP细胞中明显观察到大量CD31染色的圆形血管，表明存在大量成熟的圆形血管，血管密度显著高于年轻患者。小鼠验证通过IHC证实了VEGF/CD31的年龄依赖性上调。然后，将MMA处理的NPSC上清液与人工脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养基混合进行共培养。通过划痕愈合实验和管形成实验评估了MMA刺激的NPSC条件培养基的促血管生成能力。在划痕实验中，MMA组的划痕间隙在36小时内完全闭合，表明用MMA组条件培养基培养的HUVEC迁移能力显著增强。在管形成实验中，MMA组观察到更多的血管样结构、分支点和更长的毛细血管长度，表明HUVEC的成管能力明显更优。这些发现共同证实，MMA促进VEGF介导的椎间盘血管化，导致退变。
为了验证CCL7-JAK2/STAT3通路与VEGF在MMA诱导的IVDD中的关系，研究者使用小干扰RNA敲低CCL7
血管生成抑制剂减轻IVDD
本研究确定了VEGF介导的椎间盘血管化在IVDD中的关键作用。为了进一步阐明血管化的功能贡献，研究者使用了一种广谱VEGF抑制剂乐伐替尼在体内验证了这一机制。第3组在统一穿刺造模前接受乐伐替尼（100 mg/kg/d灌胃给药）两周，第2组和第3组接受MMA注射。第3组继续接受乐伐替尼治疗额外2周。在第35天，X射线和MRI检查显示，乐伐替尼治疗组（第3组）的DHI显著高于MMA组（第2组），改良Pfirrmann分级显著更低。收集标本的组织学染色显示，与第2组相比，第3组有残留的NP组织和部分可辨的NP-AF边界，同时组织病理学评分更低。AB和SOFG染色证实，与第2组观察到的严重耗竭相比，第3组小鼠NP区域有残留的蛋白聚糖。随后对ACAN、MMP3、VEGF和CD31的IHC检测显示，第3组椎间盘中ACAN表达更高，MMP3水平更低，表明合成/分解代谢更平衡，退变进展更轻，与影像学发现一致。血管化标志物（VEGF和CD31）在第3组也大幅减少，表明VEGF受体抑制后新生血管形成减少。这些结果最终证明，阻断病理性血管生成有效缓解了IVDD的进展。
讨论
衰老与IVDD之间存在因果关系，椎间盘结构和功能发生与年龄相关的进行性退行性变化。在退变过程中，NP表现出细胞衰老和ECM代谢失调，AF发生胶原纤维退变并形成裂隙，软骨终板发生钙化且通透性降低。然而，调控这些过程的关键分子机制仍未完全阐明。这些病理变化最终表现为以分解代谢为主的代谢失衡、ECM降解、组织水合作用降低、纤维化、存在促炎介质以及椎间高度降低。NP和AF细胞的代谢和表型是IVDD健康与疾病的关键决定因素，代谢失衡不可避免地引起生化改变。通过对老年和年轻患者IVD组织的广谱生化分析，研究者发现了代谢物的显著改变，包括MMA。此前研究表明，MMA代谢高度依赖于健康的线粒体和线粒体酶。MMA通过损害线粒体呼吸链加剧衰老，从而诱导线粒体功能障碍和氧化应激。迄今为止，尚无研究报道MMA与IVDD之间的关系。本研究代谢物分析揭示了IVD内存在MMA，且老年组织中的浓度显著高于年轻组织。鉴于MMA诱导细胞衰老，而细胞衰老与IVDD密切相关，研究者假设MMA参与了IVDD的发病机制。随后的体内外实验证实了这一假设。
为了研究MMA诱导IVDD的具体机制，研究者进行了RNA测序，将CCL7 CCL7
传统上，IVD被认为是人体内最大的无血管器官。在正常的成人IVD中，仅外层纤维环含有稀疏的微血管，NP和内层AF完全依赖于从软骨终板或外层AF的微血管通过扩散获取营养（如氧气和葡萄糖）。这种无血管状态是维持IVD低免疫原性和基质稳态的基础。IVD已经适应了这种没有直接氧气供应的独特微环境。当异常血管化发生在内层AF或NP时，被称为“椎间盘血管化”。尽管异常生长的血管可以提供一些营养，但同时会导致免疫细胞和炎症因子浸润NP细胞，从而破坏其免疫豁免。这些细胞产生丰富的生长因子和细胞因子，改变椎间盘内部微环境，损害NP细胞功能，扰乱ECM稳态并加速IVDD。椎间盘血管化也会改变NP细胞中的氧浓度，改变IVD的低氧微环境，影响NP细胞的表型和功能。这种血管长入在NP和体循环之间建立了连接，破坏了局部微环境，创造了富氧状态，损害了II型胶原和聚集蛋白聚糖的合成。此外，血管长入伴随着神经增生，在新血管周围可检测到与疼痛相关的神经递质，如P物质和CGRP，可能导致退变性腰痛。因此，这种现象并不代表生理性修复，而是反映了退变过程中组织微环境失衡的病理反应，常见于IVDD的中晚期。因此，椎间盘内新生血管形成被视为IVDD的关键初始病理步骤，是IVDD的关键病理改变。
VEGF是血管生成的关键调节因子，直接影响血管内皮细胞的活性、增殖和迁移。IVDD中VEGF的表达与疾病严重程度密切相关，VEGF水平升高标志着退变的开始。本研究发现，老年个体NP细胞中VEGF的表达更高，CD31标记的血管数量也更多。在老年人类椎间盘和MMA处理的NP细胞中都观察到VEGF表达升高。NP组织的RNA测序进一步表明血管生成参与了IVDD的发病机制。因此，研究者认为MMA通过增加VEGF表达促进椎间盘血管化，最终加速IVDD。本研究表明，VEGF表达与CCL7/JAK2-STAT3信号通路相关。这与之前许多学者的报道一致，即JAK2-STAT3通过VEGF促进血管生成并增加血管通透性。欧阳等人也证明，该信号轴的激活还促进血管内皮细胞的增殖和迁移。因此，研究者认为在IVDD进展过程中，激活的JAK2/STAT3信号增强了内皮细胞活化，驱动NP细胞内的病理性新生血管形成，最终导致椎间盘血管化。使用Stattic后在体内外VEGF和CD31表达的减少支持了本研究的观点。为了证明椎间盘血管化对IVD的不利影响，研究者在体内使用广谱VEGF受体抑制剂乐伐替尼来阻断血管化。结果表明，与仅用MMA治疗相比，MMA+乐伐替尼治疗显著减少了血管化，保留了更多的NP细胞，并改善了椎间盘退变指标。这最终证明椎间盘血管化对IVDD有害，是IVDD的重要病理变化。抑制椎间盘血管化可以减轻椎间盘退变的严重程度，抗椎间盘血管化治疗是治疗IVDD的关键靶点。
研究者提出，衰老NP细胞和老化IVD中MMA的积累破坏了ECM合成与分解之间的平衡，使平衡向分解代谢倾斜。由JAK2/STAT3通路激活驱动的病理性微血管侵袭加速了代谢失调和结构崩解，最终导致进行性的IVD功能障碍，加速IVDD。这一级联反应放大了退变NP细胞内的VEGF表达，触发血管内皮细胞活化并加速病理性微血管形成。随后的椎间盘血管化导致免疫细胞浸润增加和炎症因子积累，加剧了炎症，改变了椎间盘内微环境，加速了椎间盘退变。
局限性
本研究存在一些局限性：在验证MMA对小鼠IVDD的影响时，注射给药方式存在一定局限。然而，基于X射线、MRI和组织染色结果，仍证明MMA可在体内加速椎间盘退变，仍具有一定可靠性。IVDD是一个复杂的过程，涉及多种能量代谢或衰老相关通路。本研究侧重于衰老相关通路和IVDD。在未来的研究中，将探索IVDD条件下能量代谢的其他相关变化。尽管本研究用乐伐替尼实现了减轻椎间盘退变的目标，但临床转化相对困难。未来，将结合纳米药物递送系统或水凝胶作为载体材料，以实现局部精准可控缓释和长期有效的目标，加速临床转化。虽然使用雄性小鼠是为了最大限度地减少激素变异性，但研究者认识到这是一个显著的限制。性别是影响椎间盘免疫和退变的关键变量；因此，本研究鉴定的MMA诱导的通路可能表现出性别二态性，需要在未来的雌性模型中进行验证。除了这些生物学变量外，小鼠尾椎模型缺乏人类腰椎的生理负荷，并且存在与年龄相关的椎体延长，这些因素可能会改变退变率和表型。因此，未来需要使用腰椎或动态负荷模型来确认这些代谢相互作用。重要的是，尽管切片是标准化的，但严重的椎间盘退变本质上改变了解剖标志。MMA组中扁平的终板曲率，可能是继发于椎间盘高度和NP体积损失，代表了退变的形态学后果，应在组织学评估中加以考虑。
结论
本研 究 最 终 证 明
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