在哺乳动物体内，存在着一个精密的内置时钟，它以大约24小时为周期，有条不紊地协调着睡眠、代谢、繁殖等一系列生理活动。这个“中央时钟”就位于大脑深处的下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus, SCN）。SCN的规律运作，依赖于其内部复杂的分子钟网络以及正确的神经发育。有趣的是，有一对高度同源的转录因子——Six3和Six6，它们在SCN的早期形成过程中扮演着不可或缺的“建筑师”角色。但更令人好奇的是，即使在SCN发育成熟后，这对“双胞胎”蛋白依然在成体SCN中持续表达。这就引出了一个悬而未决的关键问题：在神经发生完成之后，Six3和Six6留在成体SCN中“值班”，究竟还在忙些什么？它们是功能冗余的“备份”，还是各自有着独特的“岗位职责”？解答这个问题，对于深入理解昼夜节律的精细调控以及相关神经内分泌疾病的机制至关重要。
为了解开这个谜团，一支由Pamela L. Mellon、Lauren E. Chun、Hanne M. Hoffmann和Karen J. Tonsfeldt等科学家领导的研究团队开展了一项巧妙的研究。他们避开了早期发育的干扰，将目光聚焦于Six3和Six6在成体SCN中的功能。该研究论文已发表于《Journal of Neuroscience Research》。
研究人员采用的核心策略是条件性基因敲除技术。他们利用在神经降压素S（Neuromedin-S, NMS）神经元中特异性表达的Cre重组酶（Nmscre ），分别敲除了携带floxed等位基因的小鼠SCN中Six3或Six6基因。NMS在约一半的SCN神经元中表达。关键的是，他们证实Nmscre 在胚胎第16.5天（E16.5）之后才在SCN中激活，这恰好位于SCN神经发生期（约E12-E15）之后。因此，这种操作能够将基因缺失效应严格限制在SCN神经发生完成之后，从而剥离发育影响，专门探究Six3和Six6在成体SCN中的功能。研究综合运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析、报告基因小鼠（tdTomatoNMS ）示踪、体外荧光素酶报告基因检测、跑轮行为监测、离体组织PER2::LUC生物发光记录、生殖功能评估（动情周期、生育力、黄体生成素LH激增、精子分析）、皮质酮节律检测以及多重RNA原位杂交（RNAscope）等多种技术手段，系统评估了敲除Six3或Six6对SCN功能及相关生理输出的影响。
研究结果
3.1 SCN中表达Nms的神经元也表达Six3和Six6
通过分析已发表的单细胞RNA测序数据集（HypoMap），研究人员发现，在SCN神经元中，28%表达Nms。而在这些Nms阳性神经元中，高达78%表达Six3，62%表达Six6，52%同时表达两者，表明Six3和Six6在NMS神经元中存在广泛共表达。利用tdTomato报告小鼠证实，Nmscre 介导的重组确实发生在SCN神经发生之后（E16.5时SCN内无重组信号），确保了条件敲除模型的有效性。
3.2 SIX6在体外调控生物钟基因Per2、Bmal1和神经递质Vip
在体外细胞实验中，过表达Six6能够显著上调生物钟核心基因Bmal1的启动子活性，下调Per2的启动子活性，并上调神经肽Vip的启动子活性，但对Avp（精氨酸加压素）启动子无显著影响。这表明Six6具备直接调控SCN关键功能基因的潜力，其作用模式与Six3既有相似也有不同。
3.3 在NMS神经元中敲除Six3或Six6不影响雌性生育力
与之前使用广泛表达的Synapsincre 敲除Six3导致雌鼠生育力下降的结果不同，特异性在NMS神经元中敲除Six3或Six6的雌性小鼠，在青春期启动（阴道开口）、动情周期长度、生育力（首次产仔时间、产仔窝数、每窝产仔数）以及诱导的LH激增方面，均与对照组小鼠无显著差异。这表明Six3在更广泛的神经元群体（而非特指NMS神经元）中调控雌性生殖功能。
3.4 在NMS细胞中敲除Six3导致条件敲除雄性小鼠精子活力降低
在NMS神经元中敲除Six3的雄性小鼠，其精子活力百分比显著下降，但精子总数、交配效率（栓子检测）以及与野生型雌鼠交配后的每窝产仔数均未受影响。敲除Six6则无此效应。值得注意的是，研究人员在睾丸中观察到了零星的Nmscre 介导的报告基因表达，提示Six3的缺失可能通过直接的睾丸局部效应影响精子活力。
3.5 在NMS神经元中敲除Six3不影响皮质酮节律
无论是在12小时光照/12小时黑暗（LD）还是持续黑暗（DD）条件下，敲除Six3的雄性小鼠皮质酮的昼夜节律（振幅和峰值时间）均未发生改变，表明Six3在NMS神经元中不参与调控下丘脑-垂体-肾上腺轴的昼夜输出。
3.6 在NMS神经元中敲除Six3（而非Six6）缩短自由运行的昼夜节律周期
这是本研究的核心发现。在持续黑暗条件下，敲除Six3的NMS神经元中敲除Six3的小鼠（Six3NMS ）以及在使用VIPcre 特异性敲除Six3的小鼠（Six3VIP ）中，其自由运行的昼夜节律周期（tau）均显著短于对照组小鼠。然而，在NMS神经元中敲除Six6的小鼠（Six6NMS ）其自由运行周期与对照组无异。通过离体PER2::LUC生物发光记录也证实，Six6NMS 小鼠的SCN及其他外周组织的节律周期正常。这表明，在成体SCN的NMS神经元中，Six3对于设定内在的昼夜节律周期具有独特且不可或缺的作用，而Six6在此功能上可能是冗余的或非必需的。
3.7 在NMS神经元中敲除Six3不影响SCN中Avp、Vip或Nms的细胞数量
尽管行为周期缩短，但通过RNAscope检测发现，敲除Six3的NMS神经元中敲除Six3的小鼠SCN内，表达Avp、Vip或Nms的神经元比例与对照组相比没有差异。这说明Six3调控节律周期的机制可能并非通过改变这些关键神经肽的表达细胞数量，而可能涉及更精细的分子钟调控或神经元网络特性改变。
研究结论与意义
本研究清晰地揭示，尽管Six3和Six6高度同源且在发育期共同调控SCN形成，但它们在成体SCN的NMS神经元中扮演着截然不同的角色。Six3发挥着设定昼夜节律周期的关键功能，其缺失会导致内在节律加速（周期缩短）。相反，Six6在成体SCN的这一特定功能上似乎并非必需。这种功能差异在雄性生殖方面也有体现，仅Six3的缺失影响了精子活力。
这一发现具有多重重要意义：
首先，它挑战了“Six3和Six6功能完全冗余”的简单假设，强调了即使在高度相似的转录因子之间，也存在特化和分工，这对于理解基因家族的进化与功能分化至关重要。
其次，研究成功地将Six3/Six6的发育功能与成体功能分离开来，首次明确了Six3在神经发生完成后对成体SCN昼夜节律起搏的持续贡献，将我们对这些转录因子的认知从“发育建筑师”扩展到了“成体节奏调节者”。
最后，该研究为理解先天性下丘脑功能障碍提供了新的分子视角。SCN节律异常与睡眠障碍、生殖问题等多种疾病相关。Six3在成体SCN中调控节律周期的独特作用，提示其可能是连接特定基因变异与昼夜节律相关表型（如睡眠相位提前综合征等）的潜在关键节点。
总之，这项研究像一位细心的侦探，利用精巧的遗传学工具，成功地将一对长相相似的“双胞胎”蛋白在成体大脑时钟中的不同“工作任务”区分开来，不仅增进了我们对生物钟核心机制的基础理解，也为相关疾病的病理机制研究和潜在治疗靶点探索开辟了新道路。
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