在肿瘤免疫治疗领域，靶向程序性死亡受体1（PD-1）等免疫检查点的抑制剂已取得显著成效，但原发性和获得性耐药问题依然突出。淋巴细胞活化基因3（LAG-3）是另一个重要的抑制性免疫检查点，它与PD-1协同作用，导致T细胞功能被深度抑制，从而逃避免疫系统的攻击。尽管PD-1/LAG-3双重阻断疗法已进入临床，但两者协同抑制T细胞功能的具体分子机制，尤其是如何调控T细胞受体（TCR）下游信号传导，仍是一个亟待阐明的“黑箱”。理解这一机制，对于开发更有效的联合免疫治疗策略至关重要。
近期，一项发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》的研究，通过多组学技术深入剖析了PD-1/LAG-3共信号对T细胞的全局性调控网络，首次将致癌转录因子MYC锁定为连接这两个检查点与TCR信号抑制的关键枢纽，为理解免疫检查点的协同作用机制提供了全新视角。
为开展此项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。首先，在Jurkat T细胞系中构建了选择性、持续激活的PD-1/LAG-3信号模型。核心方法是利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对细胞进行全局性蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。此外，研究还结合了生物信息学分析，包括使用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）算法进行上游调控因子分析，以及通过单细胞RNA测序数据（来源于超过500名癌症患者的肿瘤浸润T细胞）对关键发现进行验证。同时，研究团队构建了包含LAG-3不同保守基序（FXXL, KIEELE, EP）的一系列点突变细胞系，以及MYC功能缺失型（c-MYCΔHLH ）和功能获得型（c-MYCT58A ）突变体细胞系，用以剖析特定蛋白结构域和靶点的功能。
研究结果
1. 鉴定PD-1/LAG-3共信号抑制的TCR信号组特征
通过对比PD-1/LAG-3激活组与对照组的蛋白质组/磷酸化蛋白质组，研究人员发现了一个被广泛抑制的TCR信号组特征。关键信号蛋白如LCK在其激活位点Y394 发生去磷酸化，导致下游CD3复合物和ZAP70信号传导受阻。这提示PD-1/LAG-3信号可能通过触发LCK去磷酸化来下调TCR信号。
2. MYC是PD-1/LAG-3信号抑制的关键上游主调控因子
生物信息学分析首次将MYC鉴定为PD-1/LAG-3蛋白质组/磷酸化蛋白质组中受抑制的上游主调控因子。特别值得注意的是，MYC蛋白的S288 /S293 位点在LAG-3信号激活后显著去磷酸化，提示这两个位点可能是LAG-3信号调控的新型位点。这一发现在来自癌症患者的单细胞测序数据中得到验证，显示在PDCD1 /LAG3 双阳性肿瘤浸润T细胞中，MYC 表达受到抑制。
3. PD-1/LAG-3信号通过CBL泛素连接酶网络发挥作用
研究发现，已知受PD-1/LAG-3调控的CBL泛素连接酶家族成员CBL-B及其结合蛋白SH3KBP1在信号激活后发生高磷酸化。更重要的是，研究鉴定出CBL-B蛋白上一个全新的、与PD-1/LAG-3信号相关的磷酸化位点S634 ，推测此磷酸化可能增强了CBL-B的泛素连接酶功能，进而参与抑制MYC依赖的细胞过程。
4. 特异性抑制MYC可模拟PD-1/LAG-3的信号重编程作用
为了验证MYC抑制是否足以驱动PD-1/LAG-3的表型，研究人员分析了表达无活性MYC突变体（c-MYCΔHLH ）的T细胞。结果显示，c-MYCΔHLH 细胞调控的细胞过程与PD-1/LAG-3激活细胞高度相似，MYC和TCR核心复合物被抑制。同时，该模型也重现了MAX（MYC的异二聚体伴侣）的低磷酸化以及CBL-BS634 的高磷酸化等特征。这直接证明，靶向抑制MYC足以模拟PD-1/LAG-3共信号对T细胞的关键重编程作用。
5. LAG-3胞内基序的功能图谱：KIEELE/EP基序至关重要，EP是MYC的关键调控元件
通过对LAG-3三个保守胞内基序（FXXL, KIEELE, EP）进行系统性突变和组学分析，研究绘制了各基序的功能图谱。结果显示，KIEELE和EP双基序缺失可逆转PD-1/LAG-3介导的TCR信号抑制表型，包括恢复MYC、CD3、ZAP70的高磷酸化状态，表明这两个基序对LAG-3的抑制功能至关重要。
进一步分析发现，EP基序是MYC的关键调控元件。当EP基序被重复扩增（EPMP ）时，MYC蛋白在S62 位点（此磷酸化通常导致MYC降解）发生显著低磷酸化，MYC整体被抑制。相反，当EP基序被敲除（EPKO ）时，MYC信号被激活。研究还发现了一个与EP相关的锌指蛋白磷酸化特征，特别是ZNF148，其磷酸化水平与EP活性正相关，提示EP可能通过锌指蛋白介导的机制，参与由MYC抑制导致的TCR信号终止过程。
结论与意义
本研究通过多组学方法系统揭示了PD-1/LAG-3协同抑制T细胞功能的全新分子机制。其核心结论是：PD-1/LAG-3共信号汇聚于并抑制了关键转录因子MYC，MYC的抑制进而导致了整个TCR信号传导组件的协同性下调，从而重编程T细胞功能，使其处于耗竭或失能状态。研究首次将MYC确立为连接免疫检查点信号与TCR信号的关键枢纽。
研究的另一项重要发现是明确了LAG-3胞内结构域的功能分工，特别是KIEELE/EP双基序对抑制功能不可或缺，而EP基序是调控MYC活性的核心元件。这为开发特异性靶向LAG-3特定功能结构域的新型抑制剂提供了精确的分子靶点。
尽管本研究的数据主要来源于Jurkat细胞系，需要在原代T细胞和体内模型中进行进一步验证，但其发现具有重要的理论和临床意义。在理论上，它深化了对免疫检查点协同作用机制的理解，将MYC这一传统意义上的致癌因子与免疫调控网络紧密联系起来。在临床转化上，该研究提示，联合使用免疫检查点（PD-1/LAG-3）抑制剂与MYC抑制剂，可能是一种克服当前免疫治疗耐药困境的潜在新策略。未来，针对LAG-3的EP等特定基序开发阻断剂，或许能实现更精准、低毒的免疫治疗干预。
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