自由活动小鼠皮层各层同步双光子与三光子多平面成像

头戴式多光子显微镜能够对自由活动小鼠中分布于皮层各层的神经元群体活动进行成像，但迄今为止，这类系统一次仅限记录单一皮层层级。本文通过结合经多根光纤传递的双光子（2PE）与三光子（3PE）激发，构建了一种头戴式多平面显微镜，可实现对5个沿轴向垂直分离、分布于多个皮层层级的成像平面的近同步神经元活动成像。两条激发通路均配备远程调焦机制，用于精细轴向调节，从而能够在自由行为小鼠中跨数周对同一批神经元群体进行活动记录。该轻量化显微镜集成了机载双通道探测系统，旨在支持在明亮与黑暗条件下记录跨视觉皮层各层分布的神经元群体活动，并可在复杂跨隙（gap-crossing）行为期间对后顶叶皮层各层的活动进行成像。研究结果表明，在跨隙任务过程中，后顶叶皮层第5层与第2/3层神经元亚群在自由决策期间表现出不同的时序模式序列。

该研究发表于《Nature Methods》，围绕自由活动动物中跨皮层层级神经群体活动同步记录这一关键技术瓶颈展开。皮层不同层级的神经元在解剖结构、输入输出连接和生理功能上存在显著差异，因此，理解感觉信息如何在皮层回路中逐级转换，必须在自然行为条件下同时观测浅层与深层神经群体的动态活动。既往大规模细胞外电生理记录虽然具备极高时间分辨率和广覆盖能力，但难以准确判定细胞类型及其精确空间位置，因此与单细胞分辨率的回路重建之间仍存在对应困难。基于基因编码活动指示器的多光子成像则可将神经活动与遗传定义的细胞类型、形态重建及行为状态建立联系，但已有头戴式双光子系统多局限于单层面或上层皮层成像，受双光子激发（2PE）成像深度限制、电调焦透镜（ETL）轴向扫描范围限制及逐层顺序扫描带来的时间分辨率下降影响，难以覆盖多层皮层并实现真正近同步的跨层记录。三光子激发（3PE）虽可进入更深层皮层，但此前也未与浅层多平面近同步记录有效整合。因此，开发一种兼具2PE浅层成像优势与3PE深层成像优势、并适用于自由活动小鼠复杂行为任务的多平面头戴式显微镜，具有明确的方法学与神经科学研究价值。

研究人员据此设计并实现了一种轻量化头戴式多平面多光子显微镜，通过多根光纤分别输送4路2PE激发和1路3PE激发，并借助时间复用（temporal multiplexing）策略，使5个轴向分离的焦平面能够以近同步方式成像。系统中两条激发路径分别配置远程调焦元件，从而可微调各成像平面的轴向位置，并支持跨天追踪同一神经元群体。研究人员首先系统表征了该仪器的光学结构、点扩散函数（PSF）、串扰特性、运动稳定性、长期重复成像能力及对动物行为的影响，随后将其应用于自由活动小鼠后顶叶皮层（PPC）跨隙决策任务，比较第2/3层（L2/3）与第5层（L5）神经群体的活动序列差异。研究表明，该设备能够在单次成像中从跨多个皮层层级的>1,800个神经元近同步采集活动信号，并在数周尺度内稳定重访同一细胞群；在行为层面，动物佩戴该设备后仍可完成复杂跨隙行为；在功能层面，PPC的L2/3与L5神经元在自由决策过程中呈现不同的时间序列组织特征，其中L2/3更强地参与跨越前后的连续序列活动，而L5更偏向于决策后及奖赏获取相关时段。该研究的重要意义在于建立了一种可在自然行为中跨皮层层级同步解析神经回路动态的新平台，为将功能成像与高分辨率回路重建相结合、研究感觉输入在层间回路中的转化机制提供了方法基础。

就关键技术方法而言，研究主要采用以下几方面策略：其一，构建同步双波长激光系统，以960 nm用于2PE、1,300 nm用于3PE，并通过时间复用实现多平面并行采集；其二，利用4根2PE光纤与1根3PE光纤形成5个轴向分离焦点，结合微机电系统（MEMS）扫描器和机载硅光电倍增器（SiPM）双通道探测完成成像；其三，引入两个电可调透镜（ETL）进行远程调焦，以支持跨日重定位同一神经元群；其四，建立去混叠（de-mixing）迭代算法，去除时间复用引起的电子串扰；其五，在自由活动小鼠中结合顶部相机与红外发光二极管（IR LED）三维行为追踪；其六，使用AAV1/2-syn-jGCaMP7f标记神经元，样本为7只雄性野生型C57Bl/6小鼠，其中成像与行为分析核心数据主要来自视觉皮层（V1）与后顶叶皮层（PPC）实验队列。

在研究结果部分，论文首先以“Head-mounted multiplane microscope for imaging in freely moving mice”为题，说明研究人员如何构建该多平面显微镜。该系统通过改变各光纤末端相对于准直透镜的位置，在物镜后形成轴向分离的焦点；4个2PE平面相邻间隔为80 µm，总覆盖240 µm轴向范围，3PE平面则可独立相对调节。所有激发束共享同一MEMS扫描器，荧光信号经绿色与蓝色双通道SiPM探测，并基于时间窗进行解复用。仪器总重2.5 g，常规版本视场为450 × 600 µm²，帧率9.73 Hz；其3PE平面的横向与轴向分辨率分别为1.30 ± 0.03 µm和14.8 ± 1.1 µm，2PE平面分别为1.45 ± 0.11 µm和22.2 ± 1.8 µm。结果表明，该系统能够在浅层与深层皮层之间建立跨层多平面近同步成像能力。

在“Electronic cross-talk removal”部分，研究人员聚焦于时间复用成像带来的电子串扰问题。由于SiPM探测器、长同轴传输线和前置放大链路的高频响应限制，前序通道的信号会污染后续通道，且这种串扰具有单向性，主要影响拖尾通道。为此，研究人员建立迭代优化去混叠算法，通过从后续通道中减去前序通道一定比例的信号来最小化通道间相关性。利用10 µm荧光微球构建“真值”数据后发现，去串扰后，定义在前导通道目标区域而在后续通道中测得的平均荧光污染下降了4.4 ± 1.8倍，且与真值数据相比不再存在显著差异。该算法同样能有效去除体内GCaMP7f神经元成像数据中的通道污染，从而保证后续多平面信号定量分析的可靠性。

在“To establish the utility of the head-mounted multiplane microscope for imaging neuronal activity simultaneously from multiple planes”这一结果段落中，研究人员将该显微镜用于自由活动小鼠视觉皮层，验证其多平面同步记录能力。研究在3只小鼠的4次成像中，同时记录L2/3与L5神经群体活动。结果显示，动物自由活动期间图像稳定性良好，运动校正前所有平面的中位欧氏位移为2.40 ± 2.93 µm，80.18%的数据帧位移小于5 µm，且不同深度与不同激发模式下的运动幅度总体相近。各平面均可观察到清晰的胞体与树突Ca²⁺瞬变，证明该系统能够在真实行为状态下同步获取多层皮层神经活动。

在“Stable imaging from the same neuronal populations across weeks”部分，论文进一步评估了跨周重复成像能力与组织安全性。单次成像会话中5个平面合计记录神经元数平均为1,225 ± 439个，范围为782–1,832个。研究人员在间隔3天和18天的重复成像实验中，均能重新识别并记录相同的神经元群体，且这些细胞在不同日期仍显示相似Ca²⁺活动模式，提示远程调焦与多平面结构足以支持长期纵向追踪。与此同时，研究使用神经元静息荧光与Ca²⁺瞬变衰减时间常数τ作为光损伤指标，比较记录起始与结束阶段的变化，结果在全部平面上均未见显著差异，说明即便持续成像超过10 min，设备也未引起可检测的明显光损伤。

在行为适配性评估部分，研究人员使用配重悬挂系统减轻电缆与显微镜对动物运动的负担，并比较真实显微镜、多纤维或单纤维代理装置以及仅带追踪LED条件下的行为表现。结果表明，自由探索、奔跑速度、奔跑时间比例和总路径长度等指标在多平面显微镜与对照条件之间均无显著差异。虽然头部旋转加速度分析显示，佩戴显微装置会对部分转动动力学产生轻微但可测影响，但总体行为性能未受显著损害。该结果说明该装置及其多纤维电缆设计仍适用于较复杂的自由行为范式。

在“Linking free decision-making behavior to neuronal activity patterns across cortical layers”部分，研究人员将系统应用于PPC跨隙任务。小鼠需要估计两个高台之间的间隙距离并跳跃至目标平台以获取奖励。通过将多平面成像、行为分类与三维轨迹追踪同步，研究人员在约10 min的连续记录中采集跨多个层面的神经活动，并以动物着陆于目标平台的时刻作为行为对齐基准。结果显示，L2/3中存在一类神经元亚群，其活动在跨隙前、跨隙中和着陆后均以较稳定方式重复出现，提示PPC浅层神经群体在这一复杂自由决策行为的多个连续阶段中具有时序组织特征。

在“Differential timing of neuronal activity patterns between the cortical layers during decision making”部分，研究人员进一步比较L2/3与L5的序列活动差异。通过依据活动起始时间对神经元排序，并将行为对齐的平均荧光轨迹二值化，研究人员定义了与特定行为时间窗相关的“序列细胞”。与时间随机打乱的对照相比，L2/3和L5在着陆事件周围均呈现显著偏离随机分布的活动序列；但层间比较显示，L2/3在跨越前0–5 s和跨越后0–5 s均表现出更高密度的序列细胞，而L5的显著增强主要出现在跨越后0–5 s。进一步直接比较两层发现，L2/3在跨越前阶段显著富集活动神经元，而L5并未表现出相同特征。由此可见，在自由决策过程中，PPC浅层神经元更强烈地参与覆盖整个行为序列的重复时间结构，而深层L5神经元则更多关联于决策完成后、奖赏获取阶段的活动组织。

讨论部分围绕该显微镜的技术优势、局限性与应用前景展开。研究人员指出，该系统的核心创新在于利用多光纤时间复用策略实现多平面并行采集，因此总帧率不随平面数增加而被顺序扫描所稀释，这一点优于依赖ETL逐层切换的传统方案。与此同时，2PE与3PE的联合使浅层与深层成像优势互补，ETL则用于跨日精细重定位。研究也坦率讨论了解复用电子学带来的“ghosting”串扰问题，并说明在当前2 MHz重复频率及约450 ns脉冲间隔条件下，系统可通过后处理有效解决，但若进一步提高重复率，问题可能更复杂。作者还强调，尽管手动ROI用于保守验证，但预处理后的数据已经适合自动化神经元检测。关于组织安全性，文中认为，尽管多平面设计增加了总入射能量，但基于基线荧光与Ca²⁺衰减常数等指标未见明显组织损伤。关于行为负担，适当悬挂与配重能够有效减轻显微镜和多纤维电缆对动物的妨碍。作者同时指出，Ca²⁺成像记录的是动作电位的间接代理信号，反卷积（deconvolution）虽持续发展，但对于深层神经元和高频放电序列的精确还原仍存在局限，因此本文在序列分析中采用更直接稳健的Ca²⁺瞬变起始时间统计方法。

研究结论部分可概括为：本文所述多平面显微镜能够在执行复杂自由决策行为的小鼠中，同时记录位于L5与L2/3的神经元群体活动。通过对后顶叶皮层跨层神经群体进行近同步记录，研究人员确定了L2/3与L5在与行为结果相关的时序活动模式上的差异。借助这一能够在自由行为动物中跨皮层层级近同步记录神经活动的新型显微镜，并结合高分辨率回路重建技术，未来可在回路层面研究跨皮层层级单个神经元如何在自由行为过程中实现感觉来源输入的转换。