提前终止密码子（PTC）是导致罕见遗传性疾病（包括儿童失明）的主要致病突变类型之一。治疗性抑制这些“无义突变”提供了一种不依赖于基因和位置的策略来恢复蛋白质功能。研究人员先前的研究证实，KCNJ13基因中的W53X PTC通过破坏内向整流钾通道Kir7.1导致Leber先天性黑矇16型（LCA16），引起视网膜色素上皮（RPE）功能障碍。在此，研究人员提出了一种使用抗密码子工程化转移RNA（ACE-tRNA）促进靶向翻译通读的概念验证方法。研究人员工程化了一种编码色氨酸的抑制性tRNA（ACE-tRNATrp.UAG），使其选择性识别W53X位点的UAG终止密码子，从而掺入正确氨基酸并恢复全长Kir7.1蛋白。通过辅助依赖性腺病毒（HDAd）递送ACE-tRNA，在表达突变KCNJ13的异源系统和患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSC）-RPE细胞中，实现了通道功能的强效恢复。电生理实验证实了功能恢复，表现为内向整流电流和膜电位的恢复。重要的是，在W53X小鼠模型中，视网膜下注射HDAd-ACE-tRNATrp.UAG导致RPE生理功能的部分恢复（通过视网膜电图测量），且未观察到视网膜毒性。综上，这些发现确立了ACE-tRNA介导的抑制作为多聚离子通道无义突变的可行治疗策略，并为遗传性视网膜疾病的精准治疗提供了转化框架。
**研究背景与问题**
无义突变在信使RNA（mRNA）中引入提前终止密码子（PTC），导致截短蛋白丧失正常结构与功能，约占所有已知遗传性疾病的15%，包括囊性纤维化、杜氏肌营养不良症及某些先天性失明类型。现有治疗策略如氨基糖苷类药物的药理性通读虽可部分恢复蛋白合成，但常引入错误氨基酸，影响蛋白稳定性与功能；CRISPR/Cas9基因编辑虽能精确校正DNA变异，但具有突变特异性、递送效率低及脱靶风险高等局限性，尤其在视网膜这类终末分化组织中。因此，亟需一种可适应多种突变和基因的治疗平台。研究人员此前发现，KCNJ13基因的c.158G>A（p.W53X）无义突变导致Leber先天性黑矇16型（LCA16），该突变破坏内向整流钾通道Kir7.1，引起视网膜色素上皮（RPE）功能障碍和进行性光感受器变性。本研究旨在开发一种抗密码子工程化tRNA（ACE-tRNA）策略，通过精准识别UAG终止密码子并在翻译中插入正确氨基酸（色氨酸），恢复全长Kir7.1蛋白功能，为LCA16及其他PTC相关疾病提供概念验证治疗。
**研究内容与结论**
研究人员设计并筛选了携带CUA反密码子的人色氨酸tRNA同解码基因（ACE-tRNA
Trp.UAG），在HEK293T细胞中通过增强型绿色荧光蛋白（sfGFP）报告系统验证其对UAG PTC的读穿效率，其中tRNA-Trp-CCA 2-1（即tRNA
Trp.UAG）效果最优。共转染tRNA
Trp.UAG与GFP-Kir7.1
W53X后，免疫细胞化学和Western blot检测到全长Kir7.1蛋白定位至细胞膜；全细胞膜片钳记录显示内向整流钾电流及Rb
+激活特征恢复，膜电位超极化。在患者来源的LCA16 hiPSC-RPE细胞中，通过辅助依赖性腺病毒（HDAd）递送4拷贝tRNA
Trp.UAG（HD tRNATrp.UAG），质谱分析证实C端肽段出现，Western blot显示Kir7.1蛋白表达恢复至野生型（WT）水平的约40%；电生理记录内向电流和膜电位显著改善；吞噬实验显示光感受器外节（POS）摄取能力从212.3个/200 μm²恢复至1185.4个/200 μm²。在Kcnj13
W53X/ΔR小鼠模型中（通过CRISPR破坏WT等位基因构建），视网膜下注射HD tRNATrp.UAG后，视网膜电图（ERG）c波振幅在4周、8周和14周时分别从134.9 μV恢复至195.9 μV、214.4 μV和208.5 μV，且a波和b波振幅也有升高趋势，未见明显视网膜毒性或炎症反应。该研究证明了ACE-tRNA作为特异性、可适应多种无义突变的精准治疗策略的潜力，论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**主要关键技术方法**
1. **细胞模型**：HEK293T细胞用于筛选和功能验证；患者来源的LCA16 hiPSC-RPE细胞（携带KCNJ13 W53X突变），由hiPSC分化而来，用于内源性基因读穿评估。
2. **动物模型**：Kcnj13
W53X/ΔR小鼠（通过AAV5递送CRISPR/Cas9和等位基因特异性sgRNA破坏Kcnj13
W53X/+小鼠的WT等位基因获得）用于体内治疗效果评价。
3. **病毒载体**：采用辅助依赖性腺病毒（HDAd）递送4拷贝ACE-tRNA
Trp.UAG，通过视网膜下注射实现对RPE细胞的转导。
4. **功能检测技术**：全细胞膜片钳记录（测量内向整流钾电流、Rb
+激活电流及膜电位）；视网膜电图（ERG）测量a波、b波和c波振幅，评估光感受器和RPE功能；免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析蛋白定位；Western blot和质谱鉴定全长蛋白表达；光感受器外节（POS）吞噬实验评估RPE功能。
**研究结果**
**（1）ACE-tRNA
Trp.UAG对UAG提前终止密码子的抑制**
通过sfGFP
N150X报告系统筛选6种人色氨酸tRNA同解码基因（CCA 2-1至5-1），发现tRNA-Trp-CCA 2-1（tRNA
Trp.UAG）在HEK293T细胞中产生最高读穿效率（GFP阳性细胞42.15%±0.09%，整合平均荧光强度84±0.5 a.u.），证明该tRNA可有效通读UAG终止密码子。
**（2）tRNA
Trp.UAG介导外源Kir7.1
W53X的通读及正确通道定位**
在HEK293T细胞中共表达GFP-Kir7.1
W53X与4拷贝tRNA
Trp.UAG（剂量依赖性），免疫细胞化学显示Kir7.1蛋白从胞质分布转为细胞膜定位（Pearson相关系数显著升高，P=1.05E-15）。Western blot检测到全长蛋白（约250 kDa四聚体）表达，截短蛋白（约35 kDa）减少；流式细胞术显示Kir7.1阳性细胞从0%升至94.4%±0.8%，证实读穿产生了可正确折叠和运输的全长蛋白。
**（3）Kir7.1通道功能的恢复**
全细胞膜片钳记录显示，tRNA
Trp.UAG处理的Kir7.1
W53X细胞恢复了内向整流钾电流（-150 mV时电流密度显著高于突变细胞，P=0.004），Rb
+激活后电流增加11.7倍（与WT的9.0倍相当），静息膜电位从-12 mV超极化至-48.7 mV（P=5.15E-07），证明通道功能完全恢复。
**（4）tRNA
Trp.UAG在患者来源hiPSC-RPE细胞中恢复内源性Kir7.1功能**
HDAd递送4拷贝tRNA
Trp.UAG至LCA16 hiPSC-RPE细胞后，免疫细胞化学显示Kir7.1蛋白重新定位于细胞膜（与Na-K-ATP酶共定位，Pearson系数显著升高）。Western blot定量显示全长蛋白表达恢复至WT水平的40%（比未处理细胞增加24倍）。质谱检测到C端肽段（VSAVLYQER和TVPEFPTPLVSK），确认读穿产生完整蛋白。电生理记录显示内向钾电流和Rb
+激活电流恢复，静息膜电位从-5.39 mV超极化至-31.2 mV（P<0.0005）。POS吞噬实验表明，吞噬活性从212.3个/200 μm²恢复至1185.4个/200 μm²，接近WT水平（1442个/200 μm²），证实了RPE功能恢复。
**（5）体内恢复RPE细胞功能**
在Kcnj13
W53X/ΔR小鼠模型中（通过AAV5递送CRISPR/Cas9破坏WT等位基因），视网膜下注射HDAd-tRNA
Trp.UAG后，ERG c波振幅（反映RPE功能）在基线破坏后为134.9 μV，治疗4周升至195.9 μV，8周升为214.4 μV，14周维持208.5 μV，呈持续恢复趋势。a波和b波振幅在14周时分别增加至98.2 μV和187.0 μV。对照组（仅注射HDAd-tRNA或PBS）c波无显著变化，WT等位基因破坏组c波进行性下降至126.47 μV，证实治疗的特异性和持久性。RPE平片显示HDAd可有效转导RPE细胞，未见视网膜结构异常。
**总结讨论与研究结论**
讨论部分指出，ACE-tRNA
Trp.UAG通过将色氨酸插入UAG终止密码子实现读穿，其效率依赖于tRNA拷贝数和基因组变异对核糖体翻译的稳定性影响。与之前tRNA
Try.UGA相比，本研究中tRNA
Trp.UAG在体内外更高效地挽救了临床表型，且hiPSC-RPE细胞中读穿效果优于HEK293T细胞，提示内源mRNA水平可能更贴近临床。HDAd载体提供长期、低免疫原性的表达，避免基因组整合风险。该策略具有基因不依赖性（针对Trp-UAG无义突变），可推广至其他PTC相关疾病（如囊胞性纤维症、杜氏肌营养不良症等），覆盖约10-20%的遗传病。未来需进行定量蛋白质组学、核糖体谱分析、非人灵长类安全性和免疫原性研究。
**研究结论**：本研究证明，tRNA
Trp.UAG介导的KCNJ13 W53X无义突变读穿恢复了Kir7.1蛋白水平，并在LCA16人iPSC-RPE模型中改善了细胞功能。重要的是，它在LCA16小鼠模型中增强了视网膜功能。这些发现支持ACE-tRNA作为抑制无义突变的有前景疗法，与传统基因治疗相比具有特异性、适应性和减少脱靶效应的优点。这些结果为ACE-tRNA在更广泛的遗传性疾病中的应用铺平了道路，通过为无义突变患者提供安全、有效且量身定制的干预措施，有可能改变基因疾病的治疗格局。
