人阿尔茨海默病脑空间蛋白质组学分析揭示微环境依赖的小胶质细胞状态

疾病相关小胶质细胞状态被认为参与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的疾病进展，但对其特征及其与病理改变的关联仍缺乏系统性解析。研究人员开发了针对人脑组织样本的CODEX-CNS——一种多重蛋白成像技术及配套定制数据分析流程。研究人员对8例AD患者与8例健康对照的前额叶皮层样本共704706个细胞进行了分子图谱绘制，在同一组织切片中同步定位了血脑屏障、脑膜组分及细胞间相互作用特征。在鉴定的髓系细胞群体中，研究人员发现一种与衰老相关的边界相关巨噬细胞样小胶质亚群。进一步依据空间邻近特征对髓系细胞亚群进行分类后，研究人员鉴定出一个与致密淀粉样β（amyloid-β, Aβ）斑块显著相关的边界相关巨噬细胞样小胶质亚群，并将其命名为人斑块相关小胶质细胞（human plaque-associated microglia）。该研究揭示了AD中髓系细胞的异质性，并提供了一种在单细胞蛋白水平表征脑细胞的新空间研究方法。

本研究发表于《Nature Neuroscience》，聚焦阿尔茨海默病（AD）中髓系细胞异质性与微环境的调控关系。当前AD研究面临的核心瓶颈在于：传统单细胞测序技术需组织解离，丢失细胞空间位置信息与局部互作特征；现有空间转录组技术无法提供单细胞分辨率的深度蛋白质组信息；常规免疫组化仅能检测有限标记物，难以全面解析复杂脑区的细胞多样性。尤其跨物种研究显示，小鼠模型中鉴定的疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）在人脑中缺乏一致证据，提示亟需发展适配人脑组织的空间蛋白质组学技术，以明确人AD特异性的小胶质细胞状态。

研究人员开发了优化的CODEX-CNS技术，对16例人前额叶皮层福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本（AD与健康对照各8例）开展32重蛋白成像，结合机器学习细胞分割与定制空间分析流程，从形态、蛋白表达、空间邻域三个维度系统解析髓系细胞异质性，并通过独立样本与常规免疫荧光完成验证。

关键技术方法包括：开发含过氧化氢联合强光处理的自发荧光去除流程，适配高自荧光人脑FFPE样本；设计覆盖神经元、胶质细胞、血管、免疫细胞及AD病理标志物的32抗体面板；采用ariadne.ai深度学习模型实现复杂形态脑细胞的精准分割；基于Leiden算法分别对髓系细胞进行蛋白表达聚类、形态聚类和空间邻域聚类；结合伪时序分析与机器学习模型解析细胞状态演化与功能关联。样本来源于俄勒冈脑库与莱比锡大学解剖研究所的死后人脑组织队列。

研究结果如下：

Development of CODEX-CNS to study the human brain：研究人员成功建立CODEX-CNS流程，自发荧光去除使信噪比显著提升，可在单张切片中同时识别神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、血管及Aβ斑块，清晰区分灰质、白质与皮质分层，并实现血脑屏障各组分的精细可视化。初始队列共分割471181个细胞，灰质与白质中各类细胞密度无组间差异。

AD brains exhibit specific cell–cell interactions：空间互作分析显示，健康脑灰质中神经元与少突胶质细胞/少突胶质前体细胞（OPCs）、小胶质细胞与星形胶质细胞、小胶质细胞与血管存在显著偏好性互作；AD灰质中小胶质细胞-小胶质细胞互作显著增加，互作小胶质细胞高表达CD163与人类白细胞抗原DR亚型（HLA-DR），神经元与星形胶质细胞互作区域中神经元DNA损伤标志物γH2A.X水平升高。

Distinct microglial morphologies across tissue microenvironments：基于12项形态参数的无监督聚类将小胶质细胞分为圆形、中间型、分支状（含3个亚群）三类；分支状3型与神经元树突标记微管相关蛋白2（MAP2）显著关联，分支状2型仅在AD灰质中与Aβ、载脂蛋白E（ApoE）及神经元核抗原（NeuN）显著共定位。

Brain myeloid cells form five protein-based clusters characterized by their spatial distribution：基于10个髓系标记物的蛋白聚类鉴定出5个亚群：单核细胞（MO）、血管周围巨噬细胞（PVMs）、边界相关巨噬细胞样小胶质细胞（BLM）、小胶质细胞1（MG1）与小胶质细胞2（MG2）；BLM共表达小胶质细胞标记物跨膜蛋白119（TMEM119）与巨噬细胞标记物CD163，在AD灰质中显著富集于Aβ斑块邻近区域。

The BLM subpopulation forms the strongest association with dense Aβ plaques：BLM是距离致密Aβ斑块5μm内占比最高的髓系亚群（约40%），该关联不发生于弥散Aβ斑块；伪时序分析提示BLM可能处于PVM向小胶质细胞转化的过渡状态，且人诱导多能干细胞来源小胶质细胞在Aβ刺激下不上调CD163，支持其外周浸润起源假说。

Brain microenvironments drive the accumulation of specific myeloid phenotypes in the human AD cortex：基于30μm空间邻域的聚类鉴定出16个微环境依赖亚群，其中簇15同时高表达CD68、CD11c、HLA-DR、CD45与CD163，低表达TMEM119，紧密环绕致密Aβ斑块与反应性星形胶质细胞，被命名为人斑块相关小胶质细胞（HPAM）；HPAM在AD样本中特异性富集，其邻近微环境特征可高精度预测致密Aβ斑块的存在。

讨论部分指出，CODEX-CNS突破了人脑FFPE样本空间蛋白质组学的自荧光壁垒，首次整合蛋白表达、形态与微环境特征解析人AD髓系细胞异质性。BLM为衰老相关小胶质亚群，在AD中向Aβ斑块招募；HPAM作为BLM的病理激活亚群，兼具吞噬与抗原提呈特征，可能是AD治疗的新靶点。该技术为神经疾病的细胞机制研究提供了高分辨率空间工具，未来可拓展至更多神经退行性疾病的微环境解析。