AreTomoLive：面向实时高通量冷冻电镜断层成像的全校正去噪自动化重构流程

实现冷冻电镜断层成像（cryo-electron tomography, cryoET）与子断层平均（subtomogram averaging, STA）的全部潜力，需要高通量的数据处理能力。当前该领域软件生态分散，仍是主要障碍。研究人员开发了AreTomoLive，这是一套由两款GPU加速软件包组成的自动化预处理流程。第一部分AreTomo3简化了断层对齐与重构，新增功能可全面考虑样品几何结构并对局部对比度传递函数（contrast transfer function, CTF）进行校正。第二部分是DenoisET，它利用AreTomo3输出的全校正断层图像，在增强对比度的同时保留更多中等分辨率特征。整套流程强调自动化，支持大规模数据采集过程中的同步数据预处理。

冷冻电镜断层成像（cryo-electron tomography, cryoET）是当前原位结构生物学中解析细胞分子机器空间排布的核心技术，结合子断层平均（subtomogram averaging, STA）可在天然细胞环境下实现近原子分辨率的三维结构解析。然而，低丰度原位分子的亚纳米分辨率重构仍极具挑战，主要受限于极低的信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）、电子束诱导样品漂移导致的信号衰减，以及对比度传递函数（contrast transfer function, CTF）引起的信号离域效应。近年来并行采集方案的硬件进步显著提升了数据采集速度，但软件层面仍存在严重碎片化问题：从倾转系列电影的运动校正到断层图像的对比度增强，各处理环节依赖不同第三方软件，坐标系统与文件格式互不兼容，导致维护困难且输入输出开销巨大，无法支撑实时高通量数据处理。针对这一瓶颈，研究人员在《Nature Methods》发表了AreTomoLive集成流程，通过AreTomo3与DenoisET两个GPU加速组件，实现了从原始倾转电影到高质量去噪断层图像的端到端自动化实时预处理。研究表明，AreTomo3通过对样品厚度、局部CTF及倾转几何的全面校正，可直接基于基准数据集将6种260 kDa至4.3 MDa的分子重构至5.1–11.5 Å分辨率，无需后续的CTF细化或贝叶斯抛光。DenoisET则依托AreTomo3的高质量输入，在去噪过程中更好地保留了中等分辨率特征，避免了传统方法中因强低通滤波导致的信息丢失。该研究为cryoET从专用技术向常规化原位分析方法的转化提供了关键软件支撑。

关键技术方法上，研究人员构建了包含AreTomo3与DenoisET的双模块GPU加速流程。AreTomo3引入自适应散焦搜索范围、基于跨相关剖面的样品厚度估计、联合倾转参数优化的鲁棒CTF估计，以及融合维纳滤波与相位翻转的混合局部CTF校正策略。DenoisET基于Noise2Noise算法，通过AreTomo3的质量指标自动筛选训练集，并以棋盘伪影为终止信号实现全自动训练与推理。实验使用了公开基准数据集及多种生物样品，包括JCVI-syn3A微细胞、大鼠海马突触体、HEK293T溶酶体、人源RPE-1细胞纤毛与中心体薄层切片，以及酿酒酵母薄层切片，所有数据均在配备Falcon 4i探测器的Krios G4显微镜上采集。

研究结果分为以下两部分。

实时断层对齐与重构（Real-time tomographic alignment and reconstruction by AreTomo3）：AreTomo3分为三个模块：继承MotionCor2的各向异性电子束运动校正并组装倾转系列；迭代CTF估计与断层对齐，扩展了原有AreTomo的对齐框架；应用全局与局部对齐结果进行断层重构，可选局部CTF与α₀倾转偏移校正。研究人员实现了基于倾转图像功率谱联合优化的鲁棒CTF估计，通过重叠区块的光谱重标度补偿散焦梯度，在高倾角与大散焦不连续采集模式下仍保持高精度。此外，通过中间断层图像的深度方向互相关剖面自动估计样品厚度，避免了人工预设误差对投影匹配参考的影响。局部CTF校正采用混合滤波策略，在低空间频率采用修正维纳滤波补偿振幅振荡，高空间频率过渡至相位翻转以保留噪声统计特性，相比基于单散焦值的传统方法减少了零穿越处的强度突变。

自动化对比度增强（Automated contrast enhancement by DenoisET）：DenoisET被集成至AreTomoLive中实现全流程自动化。研究人员发现AreTomo3的局部CTF校正减少了对强低通滤波的依赖，从而在去噪后更好地保留了中等分辨率特征，而基于Warp/IsoNet单散焦校正的输入则需更强滤波，易导致特征模糊。DenoisET利用AreTomo3输出的质量指标自动筛选高质量断层图像用于训练，并在检测到足够样本后立即启动训练；通过监测棋盘伪影自动判定训练终止点，避免了实时处理中人工干预的需求。训练完成后自动对所有可用断层图像进行推理，并持续监控新生成数据进行增量去噪。

在讨论部分，研究人员指出AreTomo3的全面校正尚未被下游STA流程完全利用，当前RELION-4/5仅使用其全局对齐参数。未来工作将定义统一的形变模型以整合局部对齐与α₀倾转偏移校正，预期可加速子断层抛光收敛。进一步可通过去噪断层图像的前向投影优化局部对齐与倾转角，形成迭代优化闭环。持续提升数据处理的效率与稳健性，是将cryoET转化为常规原位结构生物学方法的关键。