创新性肽负载杂合膜纳米疫苗实现针对 HPV 相关宫颈疾病的精准个体化免疫治疗

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）相关宫颈疾病对全球女性健康构成重大风险。当前临床干预在实现病毒完全清除及控制疾病进展方面仍面临挑战，疗效有限且存在复发风险。为满足这一尚未满足的临床需求，研究人员开发了一种创新性纳米疫苗（HM-NPs@LP），该体系通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly_{lactide-co-glycolic acid}，PLGA）纳米颗粒共递送肿瘤细胞膜（tumor membranes，TMs）、细菌胞质膜（bacterial cytoplasmic membranes，EMs）和 HPV16 长肽（long peptides，LP），以诱导抗肿瘤免疫。HPV16 E5/E6/E7 LP 与 TM 可提供个体化的广谱抗原谱，包括肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens，TSAs）和肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs）。EM 作为天然佐剂增强免疫原性。所得纳米疫苗表现出均一的纳米颗粒特征（177 nm），并具有优异的稳定性与生物安全性。体外实验表明，HM-NPs@LP 可被骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）高效摄取，进而促进树突状细胞（dendritic cells，DCs）成熟并增强肿瘤特异性 T 细胞应答。小鼠模型体内研究表明，HM-NPs@LP 优先富集于淋巴结，并诱导强效肿瘤抑制。此外，该疫苗可诱导持久免疫记忆，以在全身毒性极低的情况下防止肿瘤复发。进一步地，人源化 HLA-A*02:01 转基因小鼠中亦重现了上述治疗结局。其与紫杉烷-铂类（taxane-platinum，TP）化疗及抗程序性死亡受体 1（programmed cell death protein 1，PD-1）免疫治疗联用后，可进一步增强肿瘤消退。总体而言，该纳米疫苗平台具备可规模化生产、生物安全性良好及适用于个体化免疫治疗的特征，因而成为治疗 HPV 相关宫颈疾病乃至其他恶性肿瘤的有前景的治疗策略。

本文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，围绕HPV相关宫颈疾病治疗中“预防性疫苗难以清除既有感染、癌前病变和进展期肿瘤治疗效果有限、复发风险高以及肿瘤异质性显著”这一核心临床难题，构建并系统评估了一种创新性杂合膜纳米疫苗HM-NPs@LP。研究背景在于，宫颈癌的发生发展与高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染密切相关，尤其是HPV16致癌蛋白E5、E6、E7持续表达，为治疗性免疫干预提供了明确靶点。然而，现有E6/E7导向治疗性疫苗疗效仍不足，且单一抗原策略难以覆盖宫颈癌高度异质性的抗原景观；另一方面，自体肿瘤膜虽可保留个体化肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens，TAAs）和肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigens，TSAs），但其免疫原性偏低。基于此，研究人员提出将肿瘤细胞膜、细菌胞质膜及HPV16 E5/E6/E7长肽（long peptides，LP）整合入聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly_{lactide-co-glycolic acid}，PLGA）纳米颗粒，实现抗原与天然佐剂协同递送，从而建立兼具个体化与强免疫激活能力的纳米疫苗平台。

本研究的总体结论是：HM-NPs@LP能够高效激活骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs），促进淋巴结富集和T细胞启动，在小鼠TC-1肿瘤模型、人源化HLA-A*02:01转基因模型及宫颈原位模型中均表现出显著抗肿瘤效应，并可诱导持久免疫记忆，且与紫杉烷-铂类（taxane-platinum，TP）化疗及抗PD-1治疗联用时具有协同增效作用，同时保持良好生物安全性。该研究的重要意义在于提出了一个可扩展、可定制、具有临床转化潜力的个体化免疫治疗平台，可望覆盖持续HPV感染、鳞状上皮内病变以及晚期宫颈癌等不同疾病阶段。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：基于肿瘤切除组织制备肿瘤细胞膜（TM），由大肠杆菌DH5α提取细菌胞质膜（EM），通过膜挤出构建杂合膜（HM），再以双乳化法制备负载HPV16 E5/E6/E7长肽的PLGA纳米颗粒并进行膜包覆。围绕配方表征，使用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、ζ电位、SDS–PAGE、Western blot及蛋白质组学评估结构与批次一致性。功能评估方面，采用BMDC摄取、ELISA、流式细胞术、ELISPOT、细胞毒实验、活体及离体成像、肿瘤模型疗效观察、多重免疫组化（mIHC）和人源化HLA-A*02:01转基因小鼠体系开展体内外验证；样本来源包括C57BL/6小鼠TC-1肿瘤组织及HLA-A*02:01转基因小鼠TC-1-A2-E5肿瘤组织。

一、Construction and characterization of the HM-NPs@LP nanovaccine
研究人员首先构建HM-NPs@LP纳米疫苗，将TM、EM与HPV16 E5/E6/E7长肽整合至PLGA纳米颗粒中。通过比较不同EM:TM蛋白质量比，发现3:1比例最有利于BMDC细胞因子释放和颗粒摄取，因此被确定为后续实验条件。肽设计方面，研究选择H-2D_b限制性的E5、E6、E7细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位，并以AAY连接构建嵌合长肽。结果显示，HM-NPs@LP呈规则球形，平均水合粒径为177.33 ± 4.76 nm，ζ电位较裸PLGA颗粒明显下降，提示膜包覆成功。冻干复溶及4°C储存后颗粒大小和表面电位保持稳定，BMDC摄取及活化功能未受影响。SDS–PAGE与Western blot进一步证明FtsZ和Na⁺/K⁺-ATPase等来源于EM与TM的代表性蛋白均被保留，说明杂合膜成功整合了两类膜成分。

二、In vitro immune cell activation by HM-NPs@LP
在体外免疫激活实验中，研究人员重点评估HM-NPs@LP对BMDC的摄取、成熟和信号转导作用。流式细胞术和免疫荧光结果显示，单独TM包被颗粒摄取率较低，而含EM成分的制剂摄取率显著提升，说明细菌膜成分有助于APC识别。Western blot及shRNA敲低实验表明，该识别与活化主要经由Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）-髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）经典通路介导，而TLR4作用有限。进一步ELISA和流式分析证实，HM-NPs@LP显著提高IL-6、IL-1β和TNF-α分泌，并上调CD80、CD86与主要组织相容性复合体Ⅱ类（major histocompatibility complex class II，MHC-II）表达，诱导更强的BMDC成熟。通过共定位分析，研究人员证明杂合膜平台比简单物理混合更能实现TM与EM在同一细胞内的同步递送，从而解释其 superior 的免疫激活效果。

三、HM-NPs@LP accumulated in inguinal LNs and elicited immune responses in the LNs and spleen
在体内分布与早期免疫应答研究中，研究人员先由TC-1 HPV16⁺肿瘤组织制备疫苗，然后采用皮下注射方式免疫C57BL/6小鼠。活体成像显示HM-NPs@LP可逐步富集于双侧腹股沟淋巴结，并在48 h达到峰值；离体成像表明其淋巴结信号强度明显高于EM-NPs和TM-NPs；活体显微成像及三维重建进一步证实颗粒在淋巴结细胞周围显著聚集。功能上，淋巴结内DC的CD80和CD86表达在HM-NPs及HM-NPs@LP组最为显著升高，血清IL-6、IL-1β和TNF-α也同步升高。ELISPOT结果显示，HM-NPs@LP在长肽刺激及肿瘤膜刺激条件下均诱导强烈的IFN-γ分泌T细胞应答；细胞毒实验进一步证明其诱导的T细胞可特异性杀伤HPV16⁺ TC-1细胞，而对HPV阴性的U14和MC38细胞作用有限，说明该平台可建立抗原特异性细胞免疫。

四、HM-NPs@LP exhibited potent antitumor efficacy in a murine TC-1 tumor model
在C57BL/6皮下TC-1-luciferase肿瘤模型中，当肿瘤体积约50 mm³时开始免疫治疗。IVIS和肿瘤生长曲线显示，HM-NPs@LP较肽组、物理混合组及无肽杂合膜组具有更强抑瘤效果，并在20%小鼠中实现完全肿瘤消退。终点肿瘤重量及肉眼观察均支持这一结论。机制层面，流式分析提示HM-NPs@LP促进肿瘤浸润淋巴细胞增加，尤其是CD8⁺ T细胞和CTL比例升高；TUNEL显示肿瘤细胞凋亡增加，Ki67染色显示肿瘤增殖受到抑制。多重免疫组化显示，与疗效较差组相比，HM-NPs@LP组肿瘤组织中CD8⁺ T细胞浸润增强，而耗竭性T细胞（Tex，CD8⁺PD-1⁺）和调节性T细胞（Treg，CD4⁺Foxp3⁺）显著减少，提示其能够重塑免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）。此外，在宫颈原位肿瘤模型中，HM-NPs@LP同样显著抑制肿瘤进展，说明该效应并不限于皮下环境。

五、HM-NPs@LP induced a long-lasting antitumor response
为评估免疫保护持久性，研究人员对HM-NPs@LP治疗后长期存活小鼠进行TC-1再次攻击。结果显示，再挑战小鼠在90 d观察期内未见肿瘤复发，肿瘤抑制率达到100%。与此同时，血清促炎细胞因子升高，效应记忆T细胞（effector memory T cells，Tem）扩增，表明该疫苗不仅具有初始抗肿瘤作用，还能建立长期免疫记忆。

六、HM-NPs@LP elicited antigen-specific T cells and tumor regression in a humanized HLA-A*02:01 transgenic mouse model
为验证转化潜力，研究人员构建共表达HLA-A*02:01与HPV16 E5的TC-1-A2-E5细胞，并在HLA-A*02:01转基因小鼠中开展研究。针对HLA-A*02:01限制性E5、E6、E7表位合成长肽，并构建相应四聚体。ELISPOT显示，HM-NPs@LP在长肽或TC-1-A2-E5膜刺激下均诱导更强的IFN-γ分泌T细胞应答。四聚体流式结果进一步表明，该疫苗显著提高HPV16 E5、E6、E7特异性T细胞比例；培养上清中IL-6、IL-1β和TNF-α升高，提示免疫激活增强。在治疗模型中，HM-NPs@LP同样降低肿瘤负荷，增强TUNEL阳性、降低Ki67表达，说明其在人源化免疫背景下依然保留抗肿瘤活性。

七、HM-NPs@LP enhanced therapeutic responses to TP and anti-PD-1 therapy in a humanized HLA-A*02:01 transgenic mouse model
考虑到免疫检查点抑制单药在宫颈癌中应答率有限，研究人员进一步在HLA-A*02:01转基因小鼠TC-1-A2-E5模型中评估联合治疗。结果显示，单独抗PD-1、TP或二者联用抑瘤效果有限，而凡含HM-NPs@LP的组合均可显著增强肿瘤控制，并伴随更高水平的CD8⁺ T细胞募集和功能激活。这表明HM-NPs@LP能够与化疗及免疫检查点阻断形成协同，拓展其在进展期宫颈癌中的应用前景。

八、HM-NPs@LP exhibited a favorable biosafety profile
安全性评估显示，HM-NPs@LP中脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）水平与无LPS对照相近，提示制备过程中大部分细菌来源内毒素被去除。溶血实验中，HM-NPs@LP溶血率低于3%，不同浓度下均未见明显溶血。体内组织学未发现主要脏器结构异常，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐均维持在生理范围内，治疗期间体重也无显著波动，说明该平台具有较好生物相容性与系统耐受性。

讨论部分指出，本研究针对宫颈癌免疫治疗中肿瘤异质性强、肿瘤膜免疫原性弱、免疫抑制性微环境显著等问题，提出了以TM提供个体化广谱抗原、以EM提供多模式病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）刺激、以HPV16 E5/E6/E7长肽提供明确病毒特异靶点的三组分协同策略。文章强调，相较于仅作用于单一模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）的传统佐剂，EM可通过多种PAMPs触发更广泛、更持久的先天免疫激活。研究同时指出，平台具备个体化改造潜力，可依据HPV分型和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）多态性调整抗原设计，并可结合TP或检查点抑制剂进行动态治疗优化。作者也明确提出局限性，包括尚未充分解析TM和EM中潜在免疫抑制成分、EM中仍存在外膜或胞质污染残留，以及未进一步研究术前治疗对肿瘤膜蛋白组成的影响。

研究结论部分可译为：总之，本研究成功建立了一种用于HPV相关宫颈疾病免疫学管理的创新纳米疫苗平台。通过将TM与EM融合构建HM，并进一步与具有免疫原性的HPV16长肽整合，研究人员制备了HM-NPs@LP。HM-NPs@LP依托宫颈组织样本易于获取这一临床特点，为晚期宫颈恶性肿瘤、持续性HPV感染及宫颈上皮内病变提供了有力的治疗模式。其良好的生物安全性、简化且经济的生产流程以及适用于个体化治疗方案的特征，共同为HPV相关宫颈疾病提供了新的治疗策略，并为其他恶性肿瘤免疫治疗的开发提供了重要参考。