共生菌来源乙酰胆碱增强黏膜免疫教育

微生物群可产生数千种潜在具有生物活性的小分子。针对体外培养共生菌的高通量生物活性筛选已揭示，多种微生物群代谢物可通过激活不同的G蛋白偶联受体（GPCR）塑造宿主生理。然而，由于技术限制，由复杂的饮食–微生物–宿主相互作用所形成的体内代谢组在全GPCR组范围内的生物活性仍不清楚。研究人员在此利用多重化GPCR筛选技术，评估了100株共生菌在无菌（germ-free, GF）小鼠中单菌定植生长所形成的体内代谢组，或在细菌培养基中生长形成的体外代谢组的全GPCR组生物活性。体内与体外共生菌代谢组表现出不同的GPCR激活模式，其原因包括：（1）宿主介导的代谢物降解；（2）体内微生物代谢重编程；以及（3）膳食底物的生物转化。值得注意的是，研究发现多株共生菌可在体内通过将膳食胆碱转化为乙酰胆碱（ACh）而产生ACh，其中包括在生命早期微生物组中占优势的部分双歧杆菌（Bifidobacterium）菌株以及一株益生性片球菌（Pediococcus）菌株。在机制层面，研究鉴定并表征了介导这一生物转化过程的细菌酶，分别来自短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），并构建了一株缺失ACh产生能力的同基因背景B. breve突变株。定植产ACh B. breve的小鼠表现出增强的肠道免疫球蛋白A（IgA）生成、改变的微生物群组成以及更强的肠道感染抵抗力。这些发现强调了体内环境对微生物群代谢的深刻影响，并揭示了一条能够强化黏膜免疫防御并巩固宿主–微生物群互利共生关系的饮食–微生物组–宿主轴。

这篇发表于《Nature》的研究聚焦于肠道共生菌代谢物在真实体内环境中的受体活性及其免疫学意义。既往研究主要依赖体外培养上清进行微生物代谢物筛选，虽然已证明多种微生物来源小分子可通过G蛋白偶联受体（GPCR，介导细胞外信号转导的膜受体）影响宿主能量代谢、炎症调控和黏膜屏障稳态，但体外培养体系成分简单、环境人工化，难以反映肠道内饮食、宿主和微生物共同塑造的复杂代谢生态。因此，体内微生物代谢组究竟具有怎样的全受体组活性图谱、与体外结果差异何在、这些差异是否会产生重要生理效应，仍是微生物组研究中的关键问题。正是在这一背景下，研究人员开展了系统比较体内与体外共生菌代谢组的工作。

研究人员选取100株系统发育多样的肠道共生菌，分别在标准培养条件下进行体外培养，或在无菌（GF）C57BL/6小鼠中进行单菌定植，从而构建可直接配对比较的体外与体内代谢组样本。借助多重化GPCR筛选平台PRESTO-Salsa，研究对近乎全部非嗅觉GPCR进行受体组范围测定，发现体内与体外共生菌代谢组在GPCR激活谱上存在显著差异，这种差异主要来源于宿主对微生物代谢物的降解、肠道环境诱导的细菌代谢重编程，以及膳食来源底物在体内为特定生物转化提供底物。研究最重要的发现是，多种共生菌在体内而非体外可将膳食胆碱转化为乙酰胆碱（ACh），从而激活毒蕈碱型乙酰胆碱受体（CHRM）。进一步的遗传学与功能学研究表明，短双歧杆菌（B. breve）来源ACh可增强肠道免疫球蛋白A（IgA）反应，影响微生物群落组装，并提高宿主对鼠伤寒沙门菌感染的抵抗力。该研究因此揭示了一个由饮食胆碱、共生菌ACh合成与宿主黏膜免疫共同构成的功能轴，对理解宿主–微生物互利共生机制具有重要意义。

主要技术方法概括：研究主要采用PRESTO-Salsa多重化全GPCR组筛选技术比较100株菌在体内外代谢组的受体活性；采用无菌单菌定植小鼠、抗生素处理SPF小鼠及Rag1^−/−小鼠等模型进行功能验证；通过质谱（HPLC–QTOF）定量ACh及相关代谢物；结合重组蛋白体外酶学、AlphaFold2结构建模、系统发育分析和同基因背景Δchat突变株构建解析细菌ACh合成机制；并使用scRNA-seq、bulk RNA-seq、流式细胞术、IgA/LCN2检测、16S rRNA测序及感染模型评估免疫与生态学效应。菌株来源于公开菌株库和实验室内部人肠道共生菌收藏。

以下结合论文主体内容进行分节解读。

In vitro and in vivo metabolome screens
研究首先建立了体外培养与体内单菌定植条件下的共生菌代谢组资源库。由于复杂微生物群在体内外生长时群落组成差异过大，研究人员采用单菌定植策略，以保证同一菌株在两种环境中的代谢组可直接比较。结果显示，体外与体内代谢组对多类GPCR的激活存在系统性差异。体外代谢组可激活肾上腺素能受体（AR）、多巴胺受体（DRD）、组胺受体（HRH）、5-羟色胺受体（HTR）、甲酰肽受体（FPR）和琥珀酸受体（SUCNR1）等，而相应体内代谢组虽然部分保留这些活性，但活性菌株数减少，且某些受体仅在体内显示特异激活。研究进一步将差异机制概括为三类：其一，宿主酶可在体内降解细菌代谢物，例如单胺氧化酶（MAO）可降解苯乙胺（PEA），使其体内受体活性减弱；其二，体内环境可诱导代谢重编程，导致琥珀酸或组胺相关活性下降；其三，体内存在而培养基缺失的膳食或宿主来源底物可使新的生物活性在体内出现，其中最突出者即乙酰胆碱受体激活。

Select commensals produce ACh in vivo
基于全GPCR组筛选结果，研究确认多株细菌的体内代谢组能够激活CHRM4，而对应体外代谢组不具备这一活性，包括多株双歧杆菌、拟杆菌、戊糖片球菌和链球菌。进一步使用PRESTO-Tango验证后发现，定植这些菌株的小鼠盲肠内容物确可诱导CHRM4活化。质谱检测证实，相关定植小鼠盲肠内存在较高水平ACh，而无菌对照或阴性菌株定植组中检测不到ACh。研究随后指出，标准肠道微生物培养基（GMM）缺乏胆碱这一ACh前体，因此体外未观察到ACh合成。向培养基补充1 mM胆碱后，多数候选菌株恢复了稳健的ACh产生和CHRM4激活，说明这些菌株具备ACh合成通路，但常规体外条件中受到底物可用性限制。值得注意的是，多株婴儿期占优势的双歧杆菌，尤其是B. breve和B. longum，在补充胆碱后表现出明显ACh合成能力。鉴于母乳富含胆碱相关化合物，这提示婴儿肠道可能是微生物来源ACh高水平生成的重要生态位。

Mechanisms of commensal ACh synthesis
在机制层面，研究聚焦于B. breve NWP289和P. pentosaceus NP38。研究人员在B. breve基因组中未找到哺乳动物胆碱乙酰转移酶（ChAT）的同源蛋白，转而从注释的乙酰转移酶候选基因中筛选。通过重组表达、纯化和体外酶学检测，研究确定其中一个候选酶是B. breve ACh合成的主要酶，命名为BbChAT。对P. pentosaceus进行同样分析后，鉴定出PpChAT。结构预测显示，BbChAT与PpChAT虽氨基酸同一性仅约30%，但都属于六肽重复乙酰转移酶（hexapeptide repeat acetyltransferase）家族，并与大肠杆菌麦芽糖O-乙酰转移酶（EcMoAT）具有较高结构同源性。活性位点组氨酸在两者中均保守，且对ACh合成必不可少。进一步的系统发育和功能测试表明，ACh合成能力并非该超家族的普遍属性，而是在特定支系中出现的特化功能。最终，研究通过构建Δchat B. breve突变株，证明BbChAT对B. breve合成ACh是必需的：突变株在有胆碱时也不再产生ACh，且不能激活CHRM4。

Commensal ACh enhances intestinal IgA
在功能层面，研究首先将WT B. breve与Δchat B. breve分别定植于无菌小鼠，并辅以乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEi）利斯的明以增强腔内ACh效应。结果发现，产ACh的WT菌株可通过CHRM3依赖途径增强肠道蠕动，而对粪便含水量无明显影响。更重要的是，围绕黏膜免疫的分析显示，WT B. breve与Δchat B. breve在肠固有层（LP）免疫细胞组成上总体相近，但浆细胞与初始/记忆B细胞出现转录差异。scRNA-seq与bulk RNA-seq均提示，WT定植组Igha、Aicda、Jchain、Mzb1等与IgA分化和浆细胞功能相关基因表达升高，富集分析亦指向免疫球蛋白生成、B细胞介导免疫和适应性免疫反应增强。流式细胞术进一步证实，WT B. breve提高了结肠LP中IgA浆细胞的频率与绝对数，并增加粪便IgA浓度。该效应在抗生素预处理后再定植于SPF小鼠的复杂菌群背景中依然成立。进一步分析表明，WT B. breve定植可提高粪便细菌被IgA包被的比例，并优先增强针对体内生长B. breve的IgA反应。受体阻断实验显示，广谱烟碱型ACh受体拮抗剂美加明可消除WT菌株诱导的IgA增强，而毒蕈碱型拮抗剂阿托品无显著影响，提示该免疫促进作用主要经烟碱型ACh受体介导。

ACh⁺ B. breve shapes gut ecology
鉴于IgA对群落稳态具有重要作用，研究进一步考察微生物来源ACh对肠道生态和感染抵抗的影响。先以WT或Δchat B. breve预定植小鼠，再引入简化人源肠道菌群，结果发现两组在早期群落组成相近，但随时间推移逐渐分化，到第28天时差异显著。具体而言，Δchat组中Staphylococcus sciuri、未分类Bacillaceae及Enterococcus sp.相对丰度较高，而WT组则更富集Clostridium aldenense、Eubacterium dolichum和未分类Ruminococcaceae。该结果说明，ACh生成能力可通过影响宿主黏膜免疫与微生物相互作用，进而塑造群落装配。感染实验进一步显示，在无菌单菌定植模型和复杂SPF背景模型中，WT B. breve均可增强宿主对Salmonella enterica serovar Typhimurium ΔssaV感染的抵抗力，表现为粪便中病原负荷更低；在SPF模型中，Δchat组还伴随更高的粪便LCN2水平，提示炎症加剧。由此可见，细菌ACh合成不仅影响局部免疫教育，也能转化为对病原入侵的功能性保护。

Discussion
讨论部分强调，本研究的核心贡献在于首次以受体组规模系统比较了体内与体外共生菌代谢组活性，并证明体内环境会深刻改变微生物代谢输出。作者指出，既往基于体外培养的研究只能覆盖微生物代谢潜力的一部分，而体内环境中的宿主酶作用、营养底物供给和微生物状态转换共同决定了真实的生物活性谱。研究鉴定出两种此前未表征的六肽重复家族乙酰转移酶，它们催化胆碱向ACh转化，从而填补了细菌ACh生物合成机制的空白。围绕B. breve的遗传学实验证明，微生物来源ACh可增强肠道IgA反应、提升菌株在复杂菌群中的适应度、塑造菌群结构并提高对肠道病原感染的防御能力。作者同时指出局限性：研究主要基于单菌定植，尚未覆盖复杂群落中的跨物种代谢互作；体内材料量有限，不利于低丰度代谢物深入解析；且多数功能实验使用了AChEi增强ACh效应，因此ACh在肠组织中的精确分布及其在未抑制乙酰胆碱酯酶条件下的免疫作用仍需后续研究。

研究结论部分可概括翻译如下：宿主固有菌群编码的庞大代谢能力对宿主生理塑造具有关键作用，而体外培养仅触及这一代谢宇宙的表层，往往无法捕捉其在天然生态位中发生的完整代谢活动谱。本研究强调，必须发展在生理相关环境下发掘微生物代谢组的新方法，以揭示微生物化学物质如何影响人类健康与疾病。