利用Talaromyces amestolkiae生物转化柑橘工业副产物联产纤维素酶与天然色素的综合研究

本文系统研究了Talaromyces amestolkiae真菌在液态发酵体系中利用柑橘工业副产物（RCB）同步生产天然红色素（2.15 AU500nm）和纤维素酶（如纤维二糖酶达4.16 U mL-1）的潜力。通过基因组注释发现39个β-葡萄糖苷酶编码序列，揭示了菌株通过生物转化（Biotransformation）实现农业废弃物增值的代谢可塑性。该研究为循环生物经济（Circular Bioeconomy）背景下整合基因表达-酶活性-色素生物合成的生物精炼（Biorefinery）策略提供了新范式。

摘要

农业工业副产物可作为可持续生产高附加值化合物的营养源。本研究旨在利用柑橘工业副产物（RCB）作为碳源，通过Talaromyces amestolkiae在实验室规模液态发酵中同步生产红色素和酶。结果表明，在补充商业葡萄糖和谷氨酸单钠（MSG）条件下，T. amestolkiae可代谢RCB产生红色素（336小时时500 nm处吸光度达2.15），并分泌多种酶，其中纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶）尤为突出。基因组分析揭示了T. amestolkiae中存在的酶编码序列数量：葡萄糖苷酶（39）、木聚糖酶（16）、木糖苷酶（14）、果胶酶（4）和葡聚糖酶（17）。这些发现凸显了T. amestolkiae在农业工业残留物生物转化中的代谢多样性，支持了连接基因表达、酶活性和色素生物合成的集成生物技术方法，有助于可持续生产商业价值的生物分子，强化农业工业残留物增值在循环生物经济中的作用。

引言

可持续实践需求的增长推动了对农业工业废弃物升级利用的广泛研究。特别是像柑橘副产物（RCB）这样的材料，因其丰富性和资源回收潜力而成为突出候选者。柑橘加工产生大量残留物（如果皮和果肉），富含果胶等生物活性化合物，这些材料通过微生物生物转化过程生产色素和酶等增值产品具有潜力。丝状真菌作为高效的生物转化剂，具有多功能的酶能力和对多种底物的适应性。

天然色素作为合成对应物的更安全替代品在食品、纺织和化妆品等行业中备受追捧。丝状真菌产生的天然色素表现出多种颜色，包括红色聚酮化合物、类胡萝卜素和花青素。特别是真菌Talaromyces amestolkiae因其生产高价值生物分子（如红色素和工业用酶）而受到认可。T. amestolkiae在使用半合成培养基和/或由农业工业副产物（如麦麸和柑橘副产物）组成的复杂培养基时，擅长生产氮杂蒽酮类红色素和酶（如纤维素酶和木聚糖酶）。

虽然真菌色素是一类有前景的天然色素，但其应用仍受菌株间代谢变异性和可能共产生不良代谢物（如霉菌毒素）的限制。与传统探索的属（如Monascus）相比，Talaromyces属的优势在于如T. amestolkiae等物种能够产生结构类似于Monascus的氮杂蒽酮色素，但不产生相关的霉菌毒素，这降低了通常与其他产色素真菌相关的安全问题。

关于柑橘副产物的组成，其果胶含量在塑造真菌代谢途径中起关键作用。果胶丰富的底物可影响真菌生长、代谢和产物形成。果胶裂解释放的各种寡糖和单糖作为真菌生长和代谢的底物。此外，果胶衍生化合物可作为信号分子，调节真菌中的基因表达和代谢途径。因此，了解真菌菌株、柑橘副产物底物和补充剂之间的相互作用对于改善这些生物过程中的色素产量至关重要。

重用农业工业副产物（如柑橘副产物）已成为许多研究的焦点，旨在扩大绿色经济在生物过程中的应用。特别是在甘蔗渣和橙皮等农业工业副产物的案例中，它们已被用作真菌菌株Monascus purpureus、M. ruber和Penicillium purpurogenum合成红色真菌色素的营养源。因此，为了建立T. amestolkiae生产色素的更可持续和环保的替代方法，探索使用农业工业残留物和副产物的生产方法至关重要。此外，作为生产许多工业相关化合物的替代方案，微生物生物质可通过厌氧消化作为沼气和甲烷生产的有机源，促进零浪费过程，可能有助于建立循环生物经济。

考虑到文献中有前景的研究和T. amestolkiae在生物加工中的前景，特别是在生物精炼框架内，本工作的目标是使用柑橘副产物作为T. amestolkiae的营养源，旨在生产高价值分子，即聚酮化合物色素和纤维素分解酶。此外，还进行了丝状真菌的基因组分析，以将产生的生物分子与T. amestolkiae基因组中编码酶的相应基因关联起来。

方法论

化学品和新鲜材料

RCB由Cutrale Ltda（巴西阿拉拉夸拉）捐赠，并根据Lima的方法制备。简单地说，RCB被研磨和干燥以标准化尺寸和湿度；没有进行进一步的预处理。化学品如4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷、羧甲基纤维素（CMC）、木聚糖、谷氨酸单钠（MSG）和葡萄糖等从Sigma-Aldrich等公司获得。所有其他试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。

色素和酶生物合成

本研究应用的微生物是T. amestolkiae DPUA 1275，由DPUA培养物保藏中心（巴西AM）提供。真菌保存在蒸馏水中，并根据De Oliveira的条件重新激活。培养涉及研究应用RCB在聚酮化合物色素和酶生物合成中的应用。柑橘工业副产物以56.0和28.0 g L^-1（总固体含量）的浓度应用，补充MSG、葡萄糖和盐类，如Lima所定义。接种物通过微生物的重新激活制备。简单地说，一勺真菌接种到含有10 mL PDA-YE培养基的Petri皿（90 × 10 mm）中，在30°C下培养168小时。随后，收集15个T. amestolkiae的菌丝琼脂盘（8 mm直径）并转移到250 mL锥形瓶中的50 mL液体培养基中。培养在New Brunswick Innova 40R型振荡培养箱（Eppendorf, Inc., USA）中进行，转速150 rpm，温度30°C，培养168和336小时。pH在121°C灭菌20分钟（Tecnal AV 30型高压灭菌器）前调整至5.0。

分析方法

最终pH使用pH计（Tecnal Tec 5型）测量。葡萄糖定量根据Lima的方法进行。样品通过0.45 μm过滤器（Millipore）过滤，并使用离子柱（Aminex HPX-87H, 300 × 7.8 mm, Bio-Rad）在HPLC系统（Shimadzu – LC 20AD）中分析，流动相为5.0 × 10^-3M H₂SO₄。色素生产使用分光光度计（PerkinElmer – EnSpire Alpha Plate Reader）量化。RC估计通过测量培养介质在500 nm波长处的吸光度进行，使用无真菌的培养介质作为空白归一化吸光度。结果以吸光度单位（AU）表示，考虑样品稀释。

酶活性测定

纤维素分解酶（如果胶酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶和纤维二糖酶）的酶活性（U mL^-1）根据方程（1）计算。一个活性单位（U）定义为在实验环境中每分钟每毫升酶溶液释放的还原糖量。酶测定如下进行：

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  纤维二糖酶和木糖苷酶：根据Tan的方法，使用4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷和4-硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷作为底物。
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  内切葡聚糖酶：根据Ghose的方法进行测量，使用2%（w/v）羧甲基纤维素（CMC 7 L2）在柠檬酸盐缓冲液（50 mm, pH 4.8）中。
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  木聚糖酶：根据Barbieri和Bailey的方法进行测量，使用1%（w/v）落叶松木聚糖在McIlvaine缓冲液（pH 4.0）中。
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  果胶酶：根据Silva的方法进行测量，使用0.5 mL柠檬果胶溶液在200 mm乙酸钠缓冲液（pH 5.5）中。

统计分析

所有测定均进行三次重复，结果以算术平均值及其标准偏差表示。所有统计分析的意义水平为α = 0.05，因此置信区间为95%。组间统计差异使用Tukey检验（Minitab 19.1软件）在0.05意义水平上估计。

Talaromyces amestolkiae基因组注释

T. amestolkiae基因组使用Illumina技术测序，覆盖度为150-200倍。使用MAKER2（3.01.04）流程组装和注释得到的重叠群。从MycoCosm数据库下载密切相关真菌（特别是Talaromyces proteolyticus）的蛋白质和表达序列标签，并用作初步预测的信息。使用SNAP（2006-07-28）、Augustus（3.5.0）和GeneMark-ES（4.71）进行从头预测。SNAP使用的hmm参数基于MAKER2第一轮注释。在每个从头预测步骤之后，算法生成的新信息被整合到主注释文件中，并由MAKER2用于优化注释过程。

结果与讨论

使用RCB生产色素

在进行的测定中，色素生产范围从0.31到1.86 AU_{500 nm}和从0.52到2.15 AU_500nm，分别应用28.0和56.0 g L^-1的RCB。RC生产明显受副产物量和培养基中氮源（MSG）和葡萄糖补充的影响。无论RCB浓度如何，当存在MSG和葡萄糖时，观察到最高的RC合成产量。此外，根据统计分析，在几乎所有测定中，MSG的补充与其他条件显著不同，有利于色素生产。特别值得注意的是，使用56.0 g L^-1RCB添加盐、MSG和葡萄糖培养336小时的条件，促进了最高产量，并且与其他条件统计上不同。

图1清楚地表明，联合添加柑橘副产物和MSG与葡萄糖促进了RC生产。这些结果支持了我们研究小组先前的结果，该小组多年来研究色素生产，评估了不同的氮源，如肉蛋白胨、肉提取物和无氮补充的培养基。我们先前证明，T. amestolkiae的红色素生产可以由使用的氮源导向。在早期研究中，色素主要积累在生物质中；然而，当使用MSG时，大部分色素是细胞外产生的。虽然氮杂蒽酮生物合成中涉及的完整生化反应和酶尚未完全阐明，但当前知识表明，橙色色素是通过β-酮酸（来自脂肪酸途径）与聚酮化合物发色团的酯化形成的。黄色色素来自橙色形式的还原，而红色色素通过胺化反应产生。因此，氮源的存在对于红色素形成至关重要。基于我们的发现，添加MSG促进了这一胺化步骤，增强了细胞外色素生产，并减少了培养时间。由于这些原因，MSG和盐被纳入培养基。仅使用农业工业残留物进行的培养需要更长的培养期，并导致红色色素产量较低（数据未显示） compared with the conditions described here. Although production without MSG would be desirable, the small amount added is necessary to enable efficient red colorant biosynthesis. Additionally, the literature affirms that the addition of MSG to cultivation media is primarily linked with the intensification of the extracellular colorant synthesis and emission from the cell.

总体而言，农业工业残留物表现出多重和不均匀的结构。我们研究小组先前进行了RCB的化学表征，证明其主要化合物为木质素、半纤维素、纤维素和果胶。鉴于这种复杂结构，必须考虑真菌在RCB存在下代谢重定向的可能性。这一考虑也得到了我们小组先前发现的支持，即在没有RCB的情况下实现了更高的色素生产产量。此外，我们当前的结果表明，评估的实验设置倾向于干扰RC合成（2.15 AU_500nm）。有趣的是，即使存在MSG，添加到培养基中的RCB诱导了纤维素分解酶的生产，减少了色素的积累。这些酶水解农业工业残留物，释放糖作为T. amestolkiae的碳源，T. amestolkiae在生长滞后期开始生产红色色素。

T. amestolkiae在培养培养基中的调整因实验而异，反映了含有RCB的培养基与标准培养基之间的组成差异。与此相关的是，在含有56.0 g L^-1RCB的培养基中培养336小时，由于更大的碳可利用性和MSG的存在，RC生产更高。然而，在持续168小时的测定中，T. amestolkiae可能仍在适应培养培养基，因为存在多种化合物。相反，在含有28.0 g L^-1RCB的测定中，RC合成随时间没有显示出显著差异，表明色素降解最小。事实上，根据Abel的说法，丝状真菌产生的色素以其在不同条件下的稳定性而闻名。与此相关的是，我们研究小组先前的研究表明，T. amestolkiae的色素在pH 3–11范围和温度低于50°C时是稳定的。因此，虽然最高色素生产发生在56.0 g L^-1RCB添加盐和MSG培养336小时，但使用28.0 g L^-1RCB添加盐、MSG和葡萄糖（168小时）实现的合成从工业角度突出为最有利。当涉及色素生产中的生命周期和经济分析时，培养时间是一个关键因素，直接影响生产成本。因此，考虑到上述两个条件中的色素滴度统计上相似，后者因在一半的时间和使用更少的副产物实现可比生产而突出。

一个需要审议的额外重要方面是过程中pH的变化（表S1）。这种变化在所有含MSG的实验中都观察到，在一些测定中达到7.85。这些结果表明，T. amestolkiae在添加多重和不均匀结构材料及谷氨酸的情况下的代谢从RC合成途径偏离，可能将碳通量导向酶的生产。

然而，有必要强调，本工作中使用柑橘副产物的最高RC生产与使用不同农业工业残留物的其他研究相似或优越。例如，使用橙皮作为碳源由M. purpureus生产RC达到约2.4 AU_510nm。此外，Kantifedaki等人表明，非产毒P. purpurogenum（化学分类学上与Talaromyces相关）可以从橙残留物生产Monascus样色素，支持我们选择Talaromyces型色素源，并强化培养基优化和补充是提高柑橘副产物氮杂蒽酮（红色）色素产量的主要杠杆。

在另一项使用麦麸水解物补充的研究中，T. purpureogenus的红色色素最大生产达到1.59 AU_494nm。在他们的研究中，作者强调了微生物共同利用木糖、果糖和葡萄糖的能力。

考虑到本工作的结果，尽管有RC合成，T. amestolkiae能够在培养过程结束时消耗添加的100%葡萄糖（表S1）。这些数据表明真菌生长未被RCB抑制，并强调真菌能够代谢所有葡萄糖，尽管它强化了代谢已改变的理论。因此，估计了培养介质中的酶生产。

Talaromyces amestolkiae：酶生产

为了理解T. amestolkiae的代谢及其在RCB存在下可能从色素生产偏离到其他生物分子生产，使用先前步骤的培养介质进行了一些酶的酶活性测定。图2显示了在28.0和56.0 g L^-1RCB浓度下培养168和336小时后培养介质的酶活性。

在这些实验测试中，在所有进行的测定中，几乎每种分析的酶都观察到了酶活性。活性（U mL^-1）变化为：内切葡聚糖酶从0.01到0.11；纤维二糖酶从0.20到4.16；木聚糖酶从0.00到1.07；木糖苷酶从0.08到0.76；果胶酶从0.15到0.47。在含有RCB在168小时的测定中测量的酶活性中，纤维二糖酶突出，活性约为1.8 U mL^-1。随着培养时间的延长，酶生产概况转变为显示纤维二糖酶生产的显著增加，主要在RCB 56.0 g L^-1实验中，在使用盐和葡萄糖进行的测定中达到4.16 U mL^-1。

根据文献，研究报道了T. amestolkiae在酶生产中的潜力，主要是纤维素分解酶。对于纤维二糖酶，研究描述添加葡萄糖/甘油在生产这种酶由T. amestolkiae，生产在168小时培养后从1.0到2.0 U mL^-1变化。在内切葡聚糖酶的情况下，一项评估酶合成由T. amestolkiae的研究显示酶活性从0.1到3.5 U mL^-1使用木质纤维素副产物如燕麦麸、小麦秸秆和麦麸。即便如此，木聚糖酶生产由T. amestolkiae已在文献中报道。在我们研究小组发表的一项工作中，使用不同的木质纤维素残留物，可以观察到木聚糖酶生产由T. amestolkiae，在168小时培养后达到0.32到5.41 U mL^-1的速率。这表明应用的不同碳源（如麦麸、米糠、花生皮和花生壳）可以不同地诱导木聚糖酶生产。

因此，本工作中描述的酶生产结果由T. amestolkiae与RCB补充表明从色素生产到酶生产的代谢转变，将RCB中存在的多糖（如纤维素和半纤维素）代谢成单糖，然后可以被真菌同化。

基因组编码的水解酶

所有测试的水解酶活性在T. amestolkiae的基因组中都有相应的酶基因（表1）。β-葡萄糖苷酶，在较高活性水平检测到，在基因组中具有最高数量的命中，可能存在于39个编码序列（CDS）中。木聚糖酶和β-木糖苷酶可能分别由16和14个CDS编码。多聚半乳糖醛酸酶可能仅由四个CDS编码。内切葡聚糖酶，在所有处理的活性测定中检测到非常低的水平，可能由17个CDS编码。基因组注释结果表明酶可能由底物含量诱导。根据Lima的说法，RCB包含作为主要化合物（% w/w 干重）木质素（21.6）、半纤维素（13.5）、纤维素（11.9）和果胶（5.0），这证实了本工作中观察到的结果。葡聚糖酶的低水平可能是由于RCB底物中纤维素水平低。

此外，微生物产生的酶对应于基因组中存在的编码序列，特别是内切葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。这一结果提供了经验证据，表明这些酶的基因不仅存在于微生物中，而且功能活跃。因此，如果使用纤维素底物作为T. amestolkiae的营养源，代谢途径可以导向酶生产而不是色素。酶葡萄糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶和葡聚糖酶不直接参与发酵反应，但在生物质解聚中至关重要，使微生物能够获取可发酵糖。通过这种方式，T. amestolkiae呈现产生这些酶以生成糖（葡萄糖和/或木糖）的能力，这些糖将用于中心碳代谢（如糖酵解和聚酮化合物途径）进行发酵，然后产生其他代谢物如色素。

整合基因编码、酶活性和色素生产是监测和操纵所有水平以驱动最佳生产产量的重要方法，并可以促进未来研究的集成生物技术工作流程。

结论

本工作中建立的结果表明T. amestolkiae可以将柑橘副产物代谢成纤维素分解酶和天然红色色素，证明通过生物技术可以重用农业工业副产物。此外，基因组分析揭示了编码纤维素分解酶的基因，这些酶被真菌用于消耗RCB，可以考虑将该微生物与其他副产物一起使用。然而，重要的是要理解色素和酶的生产具有不同的代谢途径，但这些化合物可以同时生产。因此，本工作有助于开发定制的培养策略，提高色素和酶产量。此类进展有助于向循环经济模式和环保工业实践的范式转变。

利益冲突

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响报道的工作。

致谢

作者感谢Cutrale®公司捐赠柑橘工业副产物。这项工作得到了圣保罗研究基金会 - 巴西的支持[拨款号 FAPESP 2019/15493-9, 2021/06686-8, 2021/09175-4, 2023/01368-3]。Valeria C. Santos-Ebinuma和Danielle B. Pedrolli感谢国家科学和技术发展委员会，巴西（CNPq – 拨款号 306475/2025-1 和 305324/2023-3）。Silvio S. da Silva感谢CNPq（拨款号 304166/2022-7）和INCT Yeasts：生物多样性、保存和生物技术创新，由CNPq资助（拨款号 406564/2022）。作者还感谢CAPES（巴西高等教育人才改进协调）的支持，财务代码001，和圣保罗州立大学（PROPE 13/2022）。本研究出版的文章处理费由Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES)资助（ROR标识符：00x0ma614）。