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鸟类肠道古菌大揭秘：特异性引物助力解锁微生物组新奥秘

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这篇研究对比了通用引物和古菌特异性引物对鸟类粪便微生物组中古菌多样性的检测效果，发现特异性引物能更好地揭示古菌多样性。研究还探讨了不同鸟类的古菌群落差异，为深入了解鸟类肠道微生物组功能提供了重要依据。

研究背景

研究目的

材料与方法

1. 样本选择和处理：选取安娜蜂鸟（Calypte anna，n = 24）、加拿大鹅（Branta canadensis，n = 40）、翻石鹬（Arenaria interpres，n = 24）和盐沼麻雀（Ammospiza caudacuta，n = 22）的粪便样本。这些样本来自先前研究，处理和测序方法基本统一，但可能存在批次效应。对盐沼麻雀样本，本研究首次用通用引物进行微生物组特征分析，DNA 提取采用改良的 ZymoBiomics DNA miniprep Kit 协议。
2. PCR 扩增：仅对盐沼麻雀样本用通用引物扩增和测序，使用针对 16S rRNA 基因 V4 可变区的引物和 GoTaq 进行 PCR 扩增。所有样本都用古菌特异性引物扩增和测序，引物带有索引序列用于两步 Illumina 文库制备。
3. 测序：盐沼麻雀的通用引物样本和所有古菌特异性引物样本在康涅狄格大学微生物分析、资源和服务（MARS）核心实验室的 Illumina MiSeq 平台上测序。测序运行包括 PCR 和提取阴性对照，所有序列数据均公开可用。
4. 序列处理：使用 DADA2 在 R 中处理原始数据，将序列处理为扩增子序列变体（ASVs），并与 SILVA rRNA 参考数据库比对，用 RDP 朴素贝叶斯分类器算法分配分类学信息。去除叶绿体、线粒体序列和潜在污染序列，将样本元数据、ASVs 和分类学信息组合成 phyloseq 对象进行分析。
5. 数据分析：用 R 进行所有分析，用 ggplot2 进行可视化。计算 ASVs 的相对丰度，用 ANCOM - BC2 计算古菌 ASVs 的差异丰度。通过稀化样本计算 alpha 多样性（观察丰富度和香农多样性），用 Wilcoxon 秩和检验比较古菌和细菌的 alpha 多样性指标。在计算共现网络前，将 ASV 计数转换为存在（1）或不存在（0），去除无古菌读数的样本，用 cooccur 包计算共现网络，仅可视化和分析显著（q < 0.05）且权重（效应大小绝对值）大于等于 0.1 的共现。

研究结果

1. 测序结果：共处理 110 份鸟类粪便样本，得到 220 个测序文库，因一个盐沼麻雀样本测序问题，最终保留 109 个样本的 218 个测序文库。通用数据集里，所有样本成功扩增，平均每个文库有 66,987 条读数和 157 个 ASVs 属于细菌和古菌；其中 42 个样本有古菌读数，平均每个文库有 114 条读数和 3 个 ASVs。古菌特异性引物在 75 个样本中检测到古菌读数，平均每个文库有 22,140 条读数和 18 个 ASVs。
2. 古菌丰度和多样性的关系：两种引物在 36 个样本中都检测到古菌，28 个样本都未检测到。39 个样本中，古菌特异性引物检测到古菌而通用引物未检测到；6 个样本则相反。古菌特异性引物检测到的读数约为通用引物的 200 倍，在 72 个样本中古菌特异性引物发现更多 ASVs，仅 7 个样本通用引物发现更多 ASVs。
3. 群落组成
   • 安娜蜂鸟：通用引物仅扩增出一个古菌属，古菌特异性引物发现 6 个古菌属。大多数安娜蜂鸟个体的古菌主要来自 Nitrososphaerales 目，用古菌特异性引物还在少数样本中检测到其他目。
   • 加拿大鹅：通用数据集中，加拿大鹅微生物群中回收的古菌属较少，样本主要由单一古菌目主导。古菌特异性引物除了检测到两个主要的产甲烷古菌目外，还发现了更多的古菌目，几乎每个样本都含有 Nitrososphaerales 目。
   • 翻石鹬：古菌特异性引物在门、纲和目水平上发现的分类多样性高于通用引物，但在科和属水平上，通用引物的多样性更高。古菌特异性引物揭示了宿主内更高的目水平多样性，多数样本含有氨氧化古菌。
   • 盐沼麻雀：盐沼麻雀样本用两种引物检测到的古菌分类多样性差异不明显，且用古菌特异性引物检测到古菌读数的样本更少。Halobacterales 目和 Nitrososphaerales 目在两种数据集中都是最丰富的目。
   • 细菌群落组成：安娜蜂鸟样本的细菌丰富度低于其他三种鸟类，每个宿主物种都有独特的细菌群落，但在门水平上存在重叠，都含有 Firmicutes 和 Proteobacteria，Actinobacteria 在除翻石鹬外的物种中丰富，Campylobacterota 在加拿大鹅和翻石鹬样本中常见，Bacteroidota 在加拿大鹅样本中常见，Fusobacteriota 在翻石鹬样本中丰富，Verrucomicrobiota 在部分盐沼麻雀样本中占主导。
4. 加拿大鹅中古菌的差异丰度：成对比较各宿主物种间古菌的差异丰度，只有涉及加拿大鹅样本时才有显著结果。与其他三种宿主物种相比，加拿大鹅样本中产甲烷菌目更为普遍。ANCOM - BC2 分析显示，加拿大鹅与其他三种宿主物种之间有两个产甲烷菌目存在显著差异，Methanomassiliicoccales 目在加拿大鹅样本中显著更丰富，Methanomicrobiales 目则显著更少。
5. Alpha 多样性：在四个宿主物种中，细菌的 ASV 数量通常比古菌高几倍，除盐沼麻雀外，其他物种的细菌 ASV 数量显著多于古菌。香农多样性方面，除盐沼麻雀外，其他物种的细菌群落香农多样性显著高于古菌群落。
6. 共现网络：共现网络分析发现，在三个可比较的宿主物种中，使用古菌特异性引物比通用引物检测到更多的古菌 - 细菌共现。在所有宿主物种中，细菌门 Firmicutes 和古菌目 Nitrososphaerales 是最常见的共现分类群。
   • 安娜蜂鸟：通用引物数据集中无古菌 - 细菌共现，古菌特异性数据集和通用细菌数据集分析发现 8 个共现，涉及的古菌都来自 Nitrososphaerales 目，细菌门为 Actinobacteria、Firmicutes 或 Proteobacteria。
   • 加拿大鹅：仅分析通用数据集时，有 134 个古菌 - 细菌共现，都涉及 Methanomassiliicoccales 目；分析古菌特异性和通用数据集时，有 495 个共现，涉及四个古菌目和九个细菌门。
   • 翻石鹬：通用数据集无共现，古菌特异性和通用数据集分析发现 22 个共现，涉及的古菌都来自 Nitrososphaerales 目，主要与 Proteobacteria 门的细菌共现。
   • 盐沼麻雀：因样本量不足，无法评估共现网络。

讨论

1. 方法学意义：古菌特异性 16S rRNA 基因引物比通用引物能检测到更多的古菌。在三个宿主物种中，古菌特异性引物增加了古菌的检测样本数和丰富度。通用引物虽能扩增样本中最丰富的古菌，但可能无法扩增较不丰富的古菌。此外，部分样本中通用引物检测到而古菌特异性引物未检测到古菌，可能是古菌特异性引物对某些类群敏感性不足，或通用引物存在假阳性扩增。
2. 生物学意义
   • 比较鸟类宿主间的古菌多样性：用古菌特异性引物检测发现，Nitrososphaerales 目在四种宿主中广泛存在，加拿大鹅中 Methanomassiliicoccales 目相对其他三种宿主更为丰富。这些差异可能受宿主大小、饮食和行为等因素影响，但研究设计可能存在批次效应，需谨慎得出生物学结论。
   • 鸟类宿主中氨氧化古菌的存在：所有四种鸟类宿主中都检测到氨氧化古菌，这与之前的研究结果一致。鸟类产生的尿酸经微生物代谢产生氨，可能为氨氧化古菌提供底物，表明氨氧化古菌在鸟类宿主中具有潜在的相关性。
   • 加拿大鹅中产甲烷古菌的差异丰度：加拿大鹅作为食叶性鸟类，其样本中产甲烷古菌的数量比其他三种宿主更多。这可能与它们的食叶性饮食有关，产甲烷古菌可与发酵细菌协同作用，帮助消化植物纤维素。虽然加拿大鹅的消化时间短，看似不允许发酵，但之前研究发现其微生物组中与细菌碳水化合物消化相关的基因和转录本富集，结合本研究结果，表明加拿大鹅可能借助微生物代谢植物分子。
   • 细菌和古菌 alpha 多样性的关系：除盐沼麻雀外，其他宿主物种中细菌的多样性显著高于古菌，这支持了在这四种鸟类宿主中，古菌在粪便微生物组总多样性中占比较小的观点。
   • 使用古菌特异性引物增加古菌 - 细菌共现的检测：在三个宿主物种中，使用古菌特异性引物检测到更多的古菌 - 细菌共现。Nitrososphaerales 目在共现中常见，但其在动物微生物组中的作用尚不清楚。产甲烷古菌与发酵细菌的代谢协同作用已被广泛研究，在加拿大鹅中，许多共现涉及甲基还原产甲烷菌目 Methanomassiliicoccales，这可能与加拿大鹅的饮食有关，但也不排除其消化更多植物纤维的可能性。共现网络分析存在局限性，未来研究应纳入定量分析，如 qPCR。
   • 古菌在动物微生物组中的作用：古菌在动物微生物组中的作用存在争议。之前研究发现古菌在宿主分类群中普遍存在，但丰度和分类多样性较低，且与宿主系统发育和饮食相关。本研究聚焦于四种生态不同的鸟类物种，虽无法用系统发育比较方法分析影响鸟类微生物组中古菌多样性的因素，但发现了宿主物种间的显著差异，如加拿大鹅中某些产甲烷菌的富集。

未来方向和建议

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