在微观的细菌世界里，革兰氏阴性菌如同隐藏在暗处的 “敌人”，时刻威胁着人类健康。它们的细胞包膜就像一层坚固的 “铠甲”，不仅保护着细菌的细胞质，还帮助细菌在复杂多变的环境中生存繁衍。其中，Tol-Pal 系统（一种在革兰氏阴性菌中负责能量传递和维持细胞包膜稳定的蛋白质复合物系统 ）在维持细胞包膜完整性方面起着关键作用，它能利用质子动力（PMF，一种由细胞膜两侧质子浓度差和电位差形成的能量形式 ）将能量从内膜传递到外膜，参与细胞分裂等重要过程。
然而，长期以来，科学家们对 Tol-Pal 系统中关键蛋白的结构和作用机制了解甚少。TolQ、TolR 等蛋白的结构一直是个谜，这就像拼图缺少了关键的几块，使得我们难以全面理解这个系统的工作原理。而且，由于缺乏对这些蛋白结构的深入认识，开发针对 Tol-Pal 系统的抗菌药物也困难重重。为了解开这些谜团，推动抗菌药物的研发，研究人员开展了深入研究。
此次研究由未知研究机构的研究人员进行，他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。研究人员通过一系列实验，成功解析了鲍曼不动杆菌中 TolQ 和 TolQ-TolR 复合物的结构，这一成果意义重大，为我们理解 Tol-Pal 系统的作用机制提供了关键线索，也为开发新型抗菌药物奠定了坚实基础。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是冷冻电镜（cryo-EM）技术，利用该技术对蛋白样品进行结构分析，获取高分辨率的蛋白结构信息；其次是分子动力学（MD）模拟，通过模拟蛋白在膜环境中的动态行为，深入研究蛋白的结构稳定性和离子通透性；最后采用 AlphaFold 建模技术，预测蛋白间的相互作用，为理解蛋白复合物的组装机制提供依据。
研究结果如下：
- TolQ 五聚体的分子结构：研究人员克隆并在大肠杆菌中表达了 TolQ 蛋白，经纯化和重构后进行冷冻电镜单颗粒重建（SPR）。结果显示，TolQ 五聚体由五个 TolQ 分子组成，长约 100Å，直径约 70Å。TolQ 单体包含七个 α 螺旋，其跨膜螺旋区域与其他蛋白存在相互作用，且与 ExbB、MotA 等蛋白结构相似。
- TolQ-TolR 复合物的冷冻电镜结构：将 TolQ 和 TolR 基因共表达并纯化后进行冷冻电镜分析，确定了 TolQ-TolR 复合物 5:2 的化学计量比。与 TolQ 单体相比，结合 TolR 后，TolQ 五聚体的中央孔从圆形变为椭圆形，以容纳 TolR 二聚体。同时，TolR 的 N 端部分定位在 TolQ 五聚体形成的细胞质腔中，其跨膜螺旋区域与 TolQ 存在特定的相互作用方式。
- TolQ-TolR 相互作用分析：通过对 TolQ-TolR 复合物结构的分析，研究人员发现多个关键氨基酸残基在维持复合物稳定性和功能方面起重要作用。例如，TolR 的 Asp27、TolQ 的 Thr148和 Thr181等残基发生突变会导致外膜不稳定。此外，还对之前体内交联实验结果进行了解释，明确了一些实验结果差异的原因。
- 评估 AcTolQ5-TolR2结构的可塑性和通透性：利用 MD 模拟研究复合物在细菌膜环境中的结构稳定性和离子通透性。结果表明，TolQ5和 TolQ5-TolR2结构在模拟过程中保持稳定，TolQ-TolR 复合物对应非通透状态，而 apo TolQ 五聚体的孔道存在脱水区域，也不具备离子通透能力。
- 分析 AcTolQ-TolR 复合物的动力学：运用 3D 变异性分析（3DVA）研究复合物的动力学，发现 TolQ 五聚体的孔道形状会发生变化，主要由其原聚体的弯曲运动驱动，同时 TolR 的 N 端存在动态折叠和重折叠过程。通过分子动力学柔性拟合（MDFF）进一步验证了这些运动。
- TolQ-TolR 与 TolA 相互作用的建模：使用 AlphaFold2 预测 TolQ-TolR 与 TolA 的相互作用模型，发现 TolA 的跨膜螺旋与 TolQ 存在特定的相互作用方式，且 TolA 与 TolR 的周质域也有直接相互作用，但该模型还需实验验证。
研究结论和讨论部分指出，研究人员提出了 TolQ-TolR-TolA 复合物的组装模型，认为 TolQ 五聚体嵌入内膜，TolR 分子的 N 端片段与之结合，TolA 通过其跨膜螺旋和周质部分与 TolQ-TolR 相互作用。同时，根据结构数据推测了 TolQ-TolR 复合物的旋转机制，认为质子转移可能导致复合物的构象变化，进而引起 TolQ 和 TolR 的旋转。此外，还讨论了 TolR 的锚定机制以及 TolA 在其中的作用。这些研究结果为深入理解 Tol-Pal 系统的工作原理提供了重要依据，也为开发针对革兰氏阴性菌的新型抗菌药物提供了潜在的靶点和理论支持，有望推动抗菌药物领域的发展，为解决革兰氏阴性菌感染问题带来新的希望。
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