在生命的微观世界里，免疫细胞就像一群训练有素的卫士，时刻守护着身体的健康。而趋化因子，便是免疫细胞行动的 “指挥官”。其中，人炎症相关 CC 趋化因子配体 5（hCCL5）更是身负重任，它不仅能调节免疫反应，还与炎症、疾病的发生发展密切相关。然而，hCCL5 在生理条件下具有显著的自组装特性，其形成寡聚体的机制和功能却一直蒙着一层神秘的面纱。以往研究虽报道了一些介导 hCCL5 寡聚化的分子间相互作用，但这些信息错综复杂，使得其结构测定困难重重。同时，不同形式的 hCCL5 在细胞内和细胞外如何发挥作用，也亟待解答。为了揭开这些谜团，来自国立清华大学（台湾）、中央研究院（台湾）等研究机构的科研人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在了《Scientific Reports》杂志上。
科研人员为了深入探究 hCCL5 的聚合机制和功能，构建了 hCCL5-K25S 突变体，通过多种前沿技术手段，如核磁共振（NMR）、小角 / 广角 X 射线散射（SWAXS）、冷冻电镜（cryo-EM）等，对 hCCL5 的结构和性质展开了全面研究。
hCCL5-K25S 突变体的构建与评估
研究人员构建 hCCL5-K25S 突变体，旨在消除 E66-K25 相互作用，保留 E66 与 R44/K45 的相互作用。通过 NMR 技术对比突变体与天然 hCCL5 结构，发现二者在酸性条件下（pH 3.2）的 NMR HSQC 谱相似，仅突变位点有显著化学位移差异，且二级结构相同，表明 K25S 突变未引起 hCCL5 的重大结构改变。
伤口愈合实验评估活性
伤口愈合实验中，hCCL5 作为激动剂，Met-hCCL5-K25S 作为拮抗剂。实验结果显示，hCCL5-K25S 处理后细胞迁移和增殖活跃，伤口愈合效果增强，而 Met-hCCL5-K25S 则表现出抑制作用，这表明 hCCL5-K25S 在促进细胞迁移方面具有趋化活性。
可溶性大量复合物的形成与分析
随着 pH 值升高，hCCL5-K25S 从二聚体逐渐形成可溶性大量复合物，NMR 信号变宽甚至消失。通过 SEC-MALS 和 DLS 实验，研究人员发现其形成了高摩尔质量、大直径的聚集体，且聚集体在 pH 降低时可解聚为二聚体，证明了其结构转变的可逆性。
分析超速离心表征聚集体
在 pH 6 条件下，分析超速离心（AUC）实验表明，hCCL5-K25S 在不同浓度下形成不同大小的聚集体，浓度越高，聚集体分子量越大，这说明其聚集程度与蛋白浓度密切相关。
荧光各向异性实验探究聚合过程
荧光各向异性实验以 Trp 为探针，研究 hCCL5-E66S 和 hCCL5-K25S 的聚合过程。结果显示，hCCL5-K25S 在 20 µM 时各向异性值更高，表明其形成了更大的复合物，且其临界聚集浓度为 140 ± 9 nM，实验中未清晰观察到二聚体，暗示二聚体可能是寡聚化过程中的瞬态群体。
透射电镜观察丝状结构
透射电镜（TEM）观察发现，hCCL5-K25S 在 0.5 - 2 µM 浓度下形成长且呈螺旋状的丝状结构，其直径与已解析的 hCCL5（4 - 68）六聚体结构匹配，且六聚体结构可延伸为丝状结构。
确定丝状结构
研究人员利用 SWAXS 和 cryo-EM 技术进一步确定 hCCL5-K25S 的丝状结构。基于 X 射线六聚体构建的丝状模型与 SWAXS 数据高度吻合，cryo-EM 虽因丝状相互作用和排列问题分辨率有限，但最终得到的密度图与模型对接良好，揭示了其螺旋结构特征。
CCL5 四聚体制备与研究
为深入研究二聚体 - 二聚体界面，研究人员设计 R44A/K45A 和 K25S/E26A/E66S 突变体，混合制备 CCL5 四聚体。SEC-MALS 分析表明，混合样品主要形成四聚体。NMR 研究发现，R44 和 K45 在四聚体形成过程中起关键作用，且二聚体 - 二聚体相互作用使 C 末端 α - 螺旋更稳定。
CCL5 丝状结构稳定性测试
通过圆二色谱（CD）测试 hCCL5 二聚体和 hCCL5-K25S 丝状结构的稳定性，发现二者二级结构性质差异显著，丝状结构的热解链温度（Tm）高达 72°C，远高于二聚体，表明其在溶液中稳定性更强。
研究结果表明，hCCL5 在体内可从单体自组装为丝状结构，K25S 突变影响其聚合过程，R44 和 K45 在二聚体 - 二聚体相互作用及丝状结构形成中至关重要。在细胞内，携带 R44/K45 的 43TRKN46 基序对 CCL5 分泌和运输至关重要，丝状结构有助于 CCL5 在细胞内的积累和运输；在细胞外，hCCL5 与糖胺聚糖（GAGs）结合影响其寡聚化和功能，肝素等可竞争结合调节 CCL5 的聚合和解离。
这项研究首次详细解析了 hCCL5-K25S 丝状聚合物的形成过程，明确了 E66-R44/K45 二聚体 - 二聚体界面结构和丝状结构，为理解 CCL5 在细胞内和细胞外的功能提供了关键线索，也为其他 CC 型趋化因子的研究提供了重要参考，有望为炎症相关疾病的治疗和药物研发开辟新的方向。
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