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长读长 16S rRNA 二代测序技术在临床诊断实验室细菌鉴定中的卓越价值与突破

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本文对比了桑格测序（16S SS）约 500bp 的 16S rRNA 基因序列和牛津纳米孔技术（ONT）长读长（~1,500nt）16S rRNA 二代测序技术对 153 株临床细菌分离株的鉴定效果。发现 16S ONT 在属水平分辨率更高，成本更低且周转时间更短，为临床细菌鉴定提供了新方案。

引言

材料和方法

1. 细菌分离株：从美国巴尔的摩约翰霍普金斯医院微生物实验室收集 153 株细菌临床分离株，其中 102 株为前瞻性临床分离株，无法用 MALDI-TOF MS 鉴定且被认为具有临床意义；51 株为根据临床和实验室标准协会（CLSI）MM18 A2 指南需更长 16S rRNA 基因序列来鉴定的挑战菌株。
2. DNA 提取：16S SS 采用 PrepMan Ultra 样本制备试剂重悬细菌、煮沸、离心后取上清用于 PCR 扩增；16S ONT 因 PrepMan Ultra 试剂干扰测序，使用 Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep 试剂盒提取 DNA，用 Qubit 4 荧光计和 NanoDrop 分光光度计分别测定 DNA 浓度和纯度。
3. 16S rRNA 桑格测序：使用 MicroSEQ 500 16S rDNA PCR 试剂盒和 Applied Biosystems 3500 基因分析仪对 16S rRNA 基因的前 500bp（V1 - V3 区域）进行测序，用 ABS Sequence Scanner 软件分析原始跟踪文件，通过 Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）搜索 IDNS 16S Centroid 数据库进行序列分类。
4. 16S rRNA ONT 测序：按照制造商建议，使用 16S Barcoding Kit 1 - 24 或 16S Barcoding Kit 24 V14 进行文库制备，分别用 FLO-MIN111（v.R10.3）或 R10.4.1 流动池在 GridION 测序仪上测序，用 MinKNOW（v.21.11.7）平台和 Guppy v.5.1.13 进行高精度碱基识别和标准过滤，测序运行包含 22 个未知细菌、1 个阳性和 1 个阴性对照，将生成的 FASTQ 文件上传到 SmartGene Advanced Sequencing 平台。
5. 生物信息学分析：SmartGene 的 16S 鉴定应用程序：将 16S ONT 的 FASTQ 文件加载到 SmartGene 的鉴定应用程序中，该程序自动执行文件转换、质量过滤、随机选择 1,000 条读长进行 BLAST 搜索、确定优势属、提取属内物种的质心序列、创建遗传图谱、比对生成共识序列、再次 BLAST 搜索并生成结果表等步骤。
6. 确定稳定可靠共识所需的最小读长：从样本记录中随机选择 84 个包含至少 1,000 条读长的记录，以所有读长生成的共识为预期共识，将文件读长逐步减少为较小子集，计算每个子集共识与预期共识的汉明距离（HD），绘制 HD 总和与读长的关系图，确定稳定共识所需的最小读长。
7. 确定 16S ONT 工作流程所需的最小测序运行时间：选择 138 个至少有 500 条读长的序列文件，确定达到 500 条读长所需时间，并比较 500 条读长和 72 小时测序后总读长所得共识的错配数和鉴定结果。
8. 分类学分类和结果报告：根据 CLSI MM18 2A 指南进行鉴定水平的判定，当未达到物种和属水平的鉴定标准时，对匹配度≥95% 的最高匹配生物进行科水平鉴定，低于 95% 则判定为无法鉴定。此外，对比 16S SS 和 16S ONT 数据的顶级分类群，计算物种水平的一致性，排除匹配长度不符合要求的物种。
9. 全基因组测序：对 16S SS 和 16S ONT 结果不一致的样本进行全基因组测序（WGS），使用 Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep 试剂盒提取 DNA，Illumina DNA Prep 制备文库，用 Illumina NextSeq 仪器测序，将数据导入 PHoeNIx 生物信息学流程进行分析和物种鉴定。
10. 统计分析：使用 McNemar 检验比较 16S SS 和 16S ONT 细菌鉴定的准确性，P 值 < 0.05 表示差异具有统计学意义。

结果

1. 读长和错配数：纳米孔平台每个样本平均产生 20,029 条读长，不同细菌组的读长数量有所差异，有氧放线菌和分枝杆菌的读长最少。重复测序部分样本后发现，多数样本重复测序的错配数几乎相同，但个别样本增加读长后鉴定结果有所改变。
2. 鉴定水平和细菌物种鉴定的一致性：根据 CLSI MM18 2A 指南，16S SS 在物种、属和科水平的鉴定率分别为 67%、21% 和 7%，16S ONT 分别为 73%、22% 和 5%，16S ONT 在属水平的鉴定能力显著提高。对于前瞻性菌株和挑战菌株，16S ONT 在不同分类水平的鉴定效果各有不同。不同细菌类群中，两种方法在物种水平的鉴定一致性有所差异，如革兰氏阳性球菌的一致性为 100%，革兰氏阴性杆菌中 16S ONT 虽能鉴定更多菌株到物种水平，但差异无统计学意义。
3. ONT 测序运行时间和获得稳定共识及可靠鉴定所需的读长：分析 84 个随机样本发现，67 个（80%）样本在 6,000 条读长时的共识与总读长的共识相同；分析 138 个样本达到 500 条读长的时间，91% 的样本在 2 小时内达到，且多数样本 500 条读长的共识与总读长的共识相同，少数样本虽有差异但不影响鉴定结果。
4. 物种水平鉴定不一致的细菌分离株的全基因组测序：对 17 个两种方法鉴定物种不一致的样本进行 WGS，多数样本因参考数据库中缺乏相关物种序列，无法确定明确的分类群，最终数据比较仍基于 CLSI MM18 2A 解释指南。
5. 难以鉴定的细菌分离株的全基因组测序：对 6 个两种方法鉴定困难的样本进行 WGS，部分样本鉴定为新物种或因数据库缺乏相应基因组无法确定物种，部分样本重新分析更新数据库后鉴定结果有所改善。
6. R10.3 和 R10.4.1 流动池性能比较：比较 R10.4.1 和 R10.3 流动池对 44 个分离株的测序结果，多数样本的最佳匹配物种和鉴定水平未改变，新化学技术未显著改善共识序列，两种技术在多数样本的鉴定结果相似。
7. 样本到报告的时间和成本：两种方法从细菌分离到生成数据的操作时间相似，但 16S ONT 文库制备和获得 500 条读长所需时间较短，且成本远低于 16S SS。

讨论

1. 两种测序方法的优势与局限：16S ONT 测序全长 16S rRNA 基因，整体鉴定准确性较高，能提高部分菌株的鉴定水平，但在某些物种中，16S ONT 的鉴定水平低于 16S SS，可能与现有鉴定指南不适用于全长测序结果有关。16S SS 仅覆盖部分基因，16S ONT 历史上碱基识别准确性较低，但 SmartGene 16S 鉴定应用程序可减少测序误差，未来 Q20 + 测序技术有望进一步提高准确性。
2. 参考数据库的重要性：全基因组测序发现，部分难以鉴定的样本可能是新物种，部分样本因参考数据库缺乏相关序列无法确定分类。参考数据库中物种的充分代表性对测序分析结果至关重要，应定期更新和维护。
3. 测序时间和成本分析：多数样本 2 小时内获得 500 条读长即可实现可靠鉴定，但放线菌和分枝杆菌等可能需要更长时间，这与它们的细胞壁组成、DNA 提取难度和基因组 GC 含量有关。16S ONT 虽操作时间未明显减少，但周转时间更短，成本更低。
4. 研究的局限性：本研究存在一定局限性，如两种测序方法输出格式不同，Sanger 测序不适用于长读长，参考数据库不完整影响结果判定，缺乏针对全长 16S rRNA 测序的解释指南，新 ONT 技术虽有改进但本研究未显示出显著差异，还需更大规模研究。

结论

打赏

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