作者：Hugues Graf、Sébastien Faure、Maelle Mellano、Stéphanie Baron、Cynthia Chapel、Fanny Savoye、Eric Richier
所属部门：赛诺菲分析科学部 – Mérieux园区，地址：1541 Avenue Marcel Merieux，69280，Marcy L’Etoile，法国
摘要
传染性样本的下游分析通常需要在隔离区外进行，因此在转移之前需要先对其进行灭活处理。本研究探讨了使用254纳米（UV-C）紫外线对腺病毒、呼肠孤病毒和狂犬病病毒的灭活效果，同时旨在确保灭活后样本仍能用于细菌内毒素测试（BET）。含有内毒素的病毒样本被暴露在不同剂量的UV-C下（范围从1到9 J/cm²）。当处理剂量为5 J/cm²（两次，每次2.5 J/cm²）且样本体积为1毫升时，病毒被完全灭活，同时内毒素也能被有效回收。对于含有细胞培养基的样本，需先稀释10倍才能有效应对紫外线的衰减并实现病毒彻底灭活。无论紫外线剂量和样本体积如何，紫外线对内毒素的影响都很小，其回收率与非灭活样本相比接近100%。通过优化紫外线照射条件，我们找到了既能有效灭活病毒又能保持BET测试特异性和适用性的剂量范围。该灭活方法适用于狂犬病疫苗样本的工业生产流程，可在隔离区外进行测试，确保生物样本的安全灭活，不存在残留生物风险。
引言
疫苗生产、质量控制和研发活动常常涉及处理高传染性病毒或细菌等传染性物质。这些病原微生物要求在安全条件下操作，必须采取适当的生物安全措施来保护工作人员和环境。世界卫生组织（WHO）建议对狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒或黄热病野毒株等活病毒的处理采用生物安全等级3（BSL3）。实验室应遵循良好的生物安全规范，例如在生物安全柜（BSC）内或封闭系统中操作传染性物质以实现一级防护。此外，BSL3实验室还需制定严格的更衣/脱衣、材料和设备消毒以及废弃物处理程序（WHO, 2020）。这些程序往往复杂、耗时且劳动强度高。
在质量控制和研发活动中，传染性样本的量通常较少，可以在生物安全柜内轻松处理。但对于某些特定测试（如细菌内毒素测试），由于气流引起的污染可能导致假阳性结果，因此不建议在BSC内进行。因此，细菌内毒素测试通常在无外部污染的专用环境中进行（例如在无人员活动且空气不流通的场所）。
药典要求对注射产品进行细菌内毒素检测，因为细菌内毒素是最常见的微生物热原，可能引发人体发热和败血症等系统症状。该测试通常在疫苗生产最终阶段进行，此时生物风险较低，因此允许在隔离区外处理样本。对于疫苗制造上游阶段的传染性物质，也会进行内毒素检测以确保最终产品中的内毒素含量处于安全水平。由于在BSC内操作可能导致假阳性结果，从而影响测试可靠性并导致生产批次被不当拒绝，因此这类样本无法在BSC内进行内毒素检测。为此，需要在较低生物安全等级下进行内毒素检测，因此样本在转移前需先进行灭活处理。
有多种化学或热处理方法可以灭活样本，以降低或消除生物风险，从而允许在隔离区外进行处理。选择哪种方法取决于其与后续分析的兼容性，需根据具体情况评估以尽量减少灭活过程中的破坏性影响。在病毒灭活方法中，热处理是首选方法，常用于疫苗研发中的废弃物消毒。高温处理（如180°C的干热处理）可用于去除内毒素。内部研究表明，80°C下处理5分钟即可有效灭活大多数病毒，且对含有细胞培养基、非离子表面活性剂或寡糖的样本，内毒素含量显著降低。然而，这类复杂基质下的加热处理可能导致内毒素信号减弱。内毒素（又称脂多糖，LPS）是高分子复合物，包含来自革兰氏阴性菌外膜的脂多糖和磷脂。LPS与非离子表面活性剂及钙螯合剂结合可能改变其结构，从而影响检测结果。因此，热处理似乎不适合作为样本灭活方法。
使用强氧化剂（如次氯酸钠）、固定剂（如甲醛、戊二醛）或酒精和氢氧化钠进行化学灭活对病毒非常有效。但这类处理可能对病毒结构、蛋白质或其他样本成分造成损害，使样本不再适合进一步检测。
紫外线照射是一种高效的方法，可有效灭活高致病性病毒（尤其是SARS-CoV-2），同时保持病毒颗粒的结构完整性。254纳米波长的UV-C照射能改变病毒核酸结构，导致DNA和RNA分子中的嘧啶残基间形成交联结构，从而阻止遗传物质的复制和转录。紫外线主要作用于核酸中的胸腺嘧啶和尿嘧啶残基。此外，紫外线还可能损伤DNA和RNA病毒的衣壳蛋白。UV-C照射的一个主要优点是仅针对核酸和嘧啶，而含有芳香族氨基酸的蛋白质/多肽受影响较小。
关于紫外线对内毒素的影响，现有研究较少。一般而言，紫外线对内毒素的化学修饰和变性作用较弱（Anderson, 2003）。然而，Wang等人的研究表明，在254纳米波长下紫外线对内毒素的影响较小。最近的研究表明，UV-C处理后内毒素含量无明显变化（Wang, Lu, and Zhang, 2019）。此外，紫外线的光能不足以引发LPS的结构变化。
最近的多项研究表明，紫外线能快速彻底灭活多种传染性病毒，从而允许在隔离区外处理样本。不过，少数研究证实UV-C处理对隔离区外进行的分析测试影响不大（Kongsomros et al., 2022, Loveday et al., 2021）。
本研究开发了一种254纳米波长的紫外线照射方法，可有效灭活多种病毒，并验证了灭活样本中细菌内毒素的可检测性。这种简单而高效的方法允许在隔离区外对样本进行检测和实验，完全消除了生物风险。
病毒与样本基质
本研究分别检测了人类腺病毒5型、呼肠孤病毒3型及狂犬病Pittman Moore病毒株，以研究紫外线对不同病毒的影响。选择这两种病毒作为模型，是为了在应用于狂犬病病毒样本之前验证紫外线灭活效果。
Wistar狂犬病Pittman Moore/WI 38 1503-3株最初由路易·巴斯德分离（Nicholson, 1989），目前用于...
紫外线照射对内毒素的影响
我们使用添加了5 IU/mL LPS参考溶液的样本，评估了紫外线照射对内毒素回收率的影响。通过将照射后的内毒素含量与照射前的理论值及未照射对照样本的内毒素含量进行比较来评估效果。
首先，使用成分简单且无色的基质研究了紫外线对LPS的影响...
讨论
研究结果表明，紫外线照射能有效灭活病毒样本，使其可以在隔离区外进行后续实验。UV-C照射可完全灭活腺病毒、呼肠孤病毒和狂犬病病毒，并可靠地检测样本中的内毒素。1毫升体积的样本在Bio-Link Crosslinker设备中接受5 J/cm²的UV-C照射...
作者贡献
资助
本项工作由赛诺菲公司资助。
作者贡献声明
GRAF Hugues的贡献：
撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源协调、项目管理、方法学设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构建。
Sébastien Faure的贡献：
撰写、审稿与编辑、验证、监督、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理、概念构建。
Maelle Mellano的贡献：
撰写、审稿与编辑、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Sandrine Raynaud和Nathalie Mantel在紫外线照射方面的科学支持和建议，以及Elisabeth Niogret-Siohan对本项目实施的协助。同时感谢Jean-Sébastien Bolduc（赛诺菲）对手稿的审阅和编辑工作，以及Sanket Mukesh Shah（赛诺菲）在编辑方面的协助。
利益冲突
所有作者均为赛诺菲公司员工，可能持有该公司股票或期权。
