转录调控因子AphBvp参与副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的毒力基因表达和生物膜形成过程

时间：2026年1月25日

来源：International Journal of Biological Macromolecules

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急性肝胰腺坏死病（AHPND）是由携带70 kbp质粒的Vibrio parahaemolyticus引起的严重虾类细菌病，其致病机制与PirA_vp和PirB_vp毒素相关。本研究通过比较野生型3HP与ΔaphB_vp突变体的转录组数据，发现AphB_vp直接调控hns_vp、dgc_vp、t6ss_vp等6个基因的表达，其中DGC_vp参与c-di-GMP合成，调控生物膜形成。RT-qPCR验证及EMSA证实AphB_vp结合上述基因启动子区，ΔaphB_vp突变体c-di-GMP水平下降，生物膜形成能力减弱，电子显微镜显示生物膜结构改变。本研究揭示了AphB_vp在毒力调控和生物膜形成中的核心作用，为AHPND防控提供新靶点。

台湾地区台北医学大学医学科学与技术学院国际转化科学博士学位项目

摘要

急性肝胰腺坏死病（AHPND）是一种严重影响全球虾养殖业的严重细菌性疾病。该疾病最初由一种携带独特约70千碱基对（kbp）质粒的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）菌株引起，这种质粒编码PirA^vp和PirB^vp二元毒素。我们之前的研究表明，AphB^vp调控这些毒素的表达。在本研究中，我们利用下一代测序（NGS）技术，比较了野生型（3HP）和缺失aphB^vp突变体（ΔaphB^vp）菌株，探讨了AphB^vp在调控与副溶血性弧菌毒力和生存相关的关键基因中的作用。RT-qPCR验证结果显示，与3HP菌株相比，ΔaphB^vp菌株中的6个基因（hns^vp、dgc^vp、t6ss^vp、tssB^vp、ifp^vp和DNA mtase^vp）的表达显著下调，而vcrH^vp基因的表达则上调。电泳迁移率测定（EMSA）证实AphB^vp可以直接结合hns^vp、dgc^vp和t6ss^vp的启动子区域。此外，AlphaFold结构预测表明DGC^vp是一种二鸟苷酸环化酶，参与生成环二鸟苷酸（c-di-GMP），这是细菌生物膜形成和持续存在的关键第二信使。细胞内c-di-GMP检测进一步显示，ΔaphB^vp菌株中的c-di-GMP浓度显著低于3HP菌株；结晶紫染色和扫描电子显微镜观察发现，ΔaphB^vp菌株形成的生物膜在生物量和结构上均发生了显著变化。综上所述，我们的研究结果表明AphB^vp可能是副溶血性弧菌毒力和生物膜形成的关键调控因子，这为疾病控制策略提供了潜在靶点。

引言

急性肝胰腺坏死病（AHPND）是一种自出现以来在全球范围内导致虾养殖业巨大损失的严重细菌性疾病[1]。在受感染区域，该病导致产量下降高达40%，某些虾塘在感染几周内的死亡率可达100%[1]、[2]、[3]。AHPND由一种携带独特约70 kb pVA1质粒的副溶血性弧菌菌株引起，该质粒编码与昆虫相关的PirA^vp和PirB^vp二元毒素[2]、[4]、[5]。AHPND的病理特征是虾的肝胰腺受到广泛损伤，而肝胰腺是负责消化和营养吸收的重要器官[6]。组织病理学分析显示肝胰腺组织出现坏死、空泡化和矿化[6]、[7]，导致细胞死亡、组织退化、器官功能丧失和细胞应激[3]、[6]、[8]。这些病理变化共同破坏了肝胰腺的完整性和功能，最终导致虾死亡[7]、[9]。组织损伤的快速进展是由存在于致病弧菌菌株中的PirA^vp和PirB^vp二元毒素驱动的[2]、[9]、[10]。 PirA^vp和PirB^vp蛋白组装成一种异源四聚体复合物，其结构与杀虫蛋白Cry毒素家族相似[11]、[12]。基于这种结构相似性，人们认为PirA^vp/PirB^vp采用了一种模仿Cry毒素家族的细胞毒性机制：PirA^vp识别宿主细胞上的糖胺聚糖受体，促进PirB^vp的结合，后者随后穿透细胞膜形成不受调控的离子通道[12]、[13]。这种孔道形成导致细胞裂解和死亡，从而在受感染的虾体内观察到典型的坏死现象[12]。此外，PirB^vp还能转移到受感染血细胞的细胞质和细胞核中，表明其具有超出孔道形成之外的其他致病机制[14]。PirA^vp和PirB^vp的联合作用对AHPND致病菌的全面毒力至关重要，并导致细胞毒性[12]、[13]、[14]。已有研究表明，pirA^vp和pirB^vp基因的表达受细菌群体感应（QS）系统的调控，该系统使副溶血性弧菌能够根据种群密度协调基因表达[15]。QS系统是一种依赖于细胞密度的调控机制，控制细菌的各种生理过程，包括毒力、运动能力、生物膜形成、孢子产生、抗生素生产和生物发光[16]、[17]、[18]、[19]。特别是生物膜的形成在副溶血性弧菌的环境持久性中起着关键作用，使细菌能够附着在池塘表面、几丁质颗粒和虾组织上，从而提高存活率并促进致病菌的传播[20]、[21]、[22]。QS系统通过感知生长环境中自诱导剂水平的波动来调控细菌的基因表达和生物膜生成[18]、[23]、[24]。在副溶血性弧菌中，除了主要调控因子OpaR（LuxR同源物）和AphA外，QS系统还涉及LuxO和AphB[15]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。LuxO已被证明能负调控pirA^vp和pirB^vp的表达[15]。当LuxO被磷酸化时，它会抑制AphB^vp的表达，进而减少pirA^vp和pirB^vp的转录。相反，删除LuxO会导致AphB^vp的表达上调，进而增加PirA^vp和PirB^vp毒素的表达[15]。在最近的一项研究中，我们进一步证实AphB^vp是pirA^vp和pirB^vp基因的正调控因子[29]。我们还发现，AphB^vp能组装成四聚体结构，低pH值（4.5）有利于其四聚体化，并增强其与pirA^vp和pirB^vp启动子区域的结合亲和力[29]。在本研究中，我们旨在探讨AphB^vp在调控副溶血性弧菌毒素产生、毒力和生物膜形成相关基因中的作用。利用下一代测序（NGS），我们比较了野生型（3HP）和缺失aphB^vp突变体（ΔaphB^vp）菌株之间的基因表达。随后通过RT-qPCR验证了aphB^vp缺失对几种差异表达基因（DEGs）的影响，并评估了AphB^vp与其启动子区域的结合能力。此外，我们还研究了二鸟苷酸环化酶（DGC^vp的结构和机制，这种蛋白通过c-di-GMP合成调控生物膜形成，其启动子区域与pirAB^vp相似。进一步分析表明，当dgc^vp基因表达较低时（如ΔaphB^vp菌株所示），细胞内c-di-GMP水平和生物膜生物量显著降低，生物膜结构也受到aphB^vp突变的影响。

RNA-seq实验准备

细菌和RNA样本的制备

将3HP和ΔaphB^vp菌株最初接种在50 mL LB+培养基（添加2% NaCl的LB培养基）中，于30°C下连续摇床振荡16小时。然后将这些菌株以1:1000的比例稀释到50 mL新鲜LB+培养基中，在相似的实验条件下培养6小时。培养结束后，收集细胞并送往BIOTOOLS有限公司（台湾台北）。提取RNA并使用Bioanalyzer验证其完整性。

通过RNA-seq分析3HP和ΔaphB^vp菌株之间的差异表达基因（DEGs）

为了深入了解AphB^vp在副溶血性弧菌中的调控作用，我们使用NGS对3HP和ΔaphB^vp菌株进行RNA-seq，以识别这两种菌株之间差异表达的基因。表S2总结了测序数据的质量控制情况。两组数据的测序错误率仅为0.02%，Q20和Q30分别超过98%和94%，表明测序数据具有很高的可靠性。总映射率约为98%，唯一映射...

讨论

副溶血性弧菌是导致养殖虾AHPND的主要病原体，主要通过质粒编码的PirA^vp和PirB^vp毒素发挥作用[2]。然而，其毒力表达受到复杂调控网络的调节，这些网络涉及多种调节因子、启动子、激活剂和抑制剂，它们对环境中的不同信号作出响应。在这些调节因子中，AphB^vp在细菌生理学和致病性方面表现出重要作用。

结论

我们的研究扩展了目前对AphB^vp作为副溶血性弧菌多功能转录调控因子的理解。我们证明了AphB^vp是hns^vp、dgc^vp、t6ss^vp、tssB^vp、ifp^vp和DNA mtase^vp的正调控因子，同时是vcrH^vp基因的负调控因子。AphB^vp与hns^vp、dgc^vp和t6ss^vp的启动子DNA结合，揭示了一个复杂的调控网络，AphB^vp可以利用这一网络来调控副溶血性弧菌的毒力和生物膜形成。

CRediT作者贡献声明

迈克尔·埃尼奥拉·阿耶内罗（Michael Eniola Ayenero）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、研究。 拉米娅·库马尔（Ramya Kumar）：可视化、验证、方法学、研究。 王汉青（Han-Ching Wang）：可视化、验证、监督、正式分析。 黎福天（Phuoc Thien Le）：可视化、方法学。 陈玉萱（Yu-Hsuan Chen）：可视化、方法学。 罗楚芳（Chu-Fang Lo）：监督、资源获取、概念构思。 林信珍（Shin-Jen Lin）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。

资助

本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC112-2313-B-006-007-MY3、NSTC113-2313-B-038-002、NSTC114-2313-B-038-005-MY3、NSTC 114-2640-B-006-005和MOST109-2313-B-038-001-MY3）、台湾农业部动物植物卫生检验局（113AS-5.1.2-VP-05、114AS-5.1.2-VP-08）以及教育部高等教育Sprout项目对国立成功大学的支持。