人类和动物中的传染病暴发——如SARS-CoV-2、寨卡病毒和多种猪病原体——继续对全球健康和经济造成巨大负担，这凸显了快速、灵敏且可快速部署的诊断方法的需求[1]、[2]、[3]。在现有方法中，定量PCR（qPCR）由于其高特异性和灵敏度仍是核酸检测的金标准。然而，它依赖于中央实验室、复杂的样本处理过程以及昂贵的热循环仪器，这严重限制了其在即时检测（POCT）中的应用，尤其是在资源有限的条件下。尽管有替代的等温扩增技术（如环介导的等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶/扩增（RPA/RAA），但它们通常在复杂临床样本中的特异性较低[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。
基于CRISPR的诊断技术（CRISPR-Dx）是一种设备要求低的病原体检测技术[10]。CRISPR-Dx通常将等温扩增方法（最常见的是LAMP或RPA）与RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶（如Cas12或Cas13）结合，以实现灵敏的病原体检测[11]、[12]、[13]、[14]。当CRISPR识别到目标核酸时，Cas酶会切割报告分子，产生可通过多种方式检测到的信号，包括侧向流动条或荧光读数[11]、[12]、[13]、[14]。虽然将等温扩增与CRISPR结合提高了检测的特异性和灵敏度，但也增加了工作流程的复杂性。为了解决这些问题，开发了如SCOPE和SHINE等一步法平台[8]、[15]。尽管取得了这些进展，但目前的许多一步法或“集成仪器”的CRISPR-Dx系统主要集中在设备设计上[16]。特别是，大多数平台仍依赖于加热模块或专用硬件进行核酸提取、病毒灭活或温度调节，这大大增加了操作复杂性[8]、[16]。这些设备的成本、维护要求和有限的可获得性成为在资源有限环境中应用的障碍，从而限制了CRISPR-Dx在真正意义上的即时检测（POCT）或家庭诊断中的实用性。因此，开发一种无需仪器且保持高灵敏度和快速检测的系统仍然是一个亟待满足的需求。
PubMed搜索（2026年1月6日进行）使用关键词“CRISPR-Dx”和“virus”发现，过去两年发表的大多数基于CRISPR的病毒诊断研究仍严重依赖商业核酸提取试剂盒[17]、[18]、[19]。尽管多年前就引入了HUDSON和Chelex-100等化学裂解策略，但由于它们依赖于重复的高温孵育步骤和温度控制设备，这些方法在实际应用中并未得到广泛采用，这严重限制了它们在资源有限或现场环境中的适用性[20]、[21]。SHINEv.2部分解决了这个问题，它使用了一种商用常温裂解试剂，从而消除了对加热设备的需求；然而，这种改进以牺牲灵敏度和整体检测时间为代价，表明在快速裂解与高CRISPR检测性能之间找到平衡的难度[10]。为了克服这些限制并在常温条件下实现高效样本处理，我们开发了LUCID，这是一种化学定义的、无需提取的裂解缓冲液，完全兼容基于CRISPR的检测方法，无需加热模块或商业试剂盒。同时，我们解决了当前CRISPR-Dx平台的另一个主要问题：几乎所有现有系统都依赖于Cas12a或Cas13a，这些酶对PAM和PFS有严格要求，限制了crRNA的设计，使其不适用于遗传多样性高或突变频繁的病毒病原体[8]、[10]、[11]、[22]。此外，Cas12a还会与等温扩增酶竞争DNA模板，降低了一步反应的效率[22]。RspCas13d是一种紧凑的VI-D效应蛋白，具有多个优势，包括不依赖于PAM/PFS以及较小的分子尺寸，有利于蛋白质表达和工业规模生产[23]。然而，其在病毒诊断中的应用仍然有限，所有现有研究都依赖于两步反应格式[24]、[25]。为了解决这一问题，我们开发了FLASH，这是第一个基于RspCas13d的一步法检测系统，并将其与LUCID集成，形成了一个完全无需提取、可在常温下使用的诊断工作流程。最后，通过采用稳定的冻干配方并在室温和生理温度下实现稳健运行，LUCID–FLASH实现了从样本到检测结果的真正无需仪器的检测。这些改进共同推动了CRISPR-Dx在资源有限环境和家庭检测场景中的实际应用，填补了该领域的多个技术空白。
非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种高度传染性的病原体，可导致家猪和野猪急性出血热，死亡率接近100%。ASF的暴发在全球范围内造成了巨大的经济损失，主要是由于大规模扑杀和贸易限制[26]。通过删除ASFV菌株中的毒力基因（特别是CD2v和MGF360/505）开发的减毒活疫苗（LAVs）在实验和实际应用中显示出良好的效果[27]、[28]、[29]。然而，安全性问题仍然存在，包括恢复毒力的风险和不良反应[30]、[31]。到目前为止，尚未开发出商用ASFV疫苗或治疗干预措施，早期诊断对于控制疫情至关重要。自ASF病毒引入中国以来，市场上出现了未经授权的ASFV疫苗。因此，开发一种能够同时检测野生型和基因缺失ASFV菌株的诊断平台对于有效监测和控制疫情至关重要。因此，持续监测野生型和基因缺失菌株是必要的，迫切需要快速、灵敏且可快速部署的诊断方法以实现ASFV的及时检测和控制。
我们开发了LUCID–FLASH，这是一种快速、用户友好且可在现场使用的ASFV及其基因缺失菌株检测平台。我们首次定义并优化了RAA–RspCas13d反应系统的化学组成，该系统能够在单管一步等温反应中同时支持RAA扩增、T7转录和RspCas13d介导的检测。为了简化样本处理，我们引入了LUCID（即利用化学集成进行直接检测的裂解方法），这是一种在室温下无需提取的裂解方法，消除了对商业试剂盒和重复加热步骤的需求。这些创新降低了检测的复杂性，并消除了对仪器的依赖。重要的是，FLASH反应在生理温度（37°C）和常温（25°C）下都能稳定运行，确保了在不同环境条件下的灵活性。此外，试剂的冻干处理保证了长期稳定性和便捷的现场部署。我们证明LUCID–FLASH的检测灵敏度和特异性均达到100%，可与qPCR相媲美，并能在30分钟内准确区分野生型和基因缺失菌株。总体而言，这些结果表明LUCID–FLASH是一种稳健、可扩展且无需仪器的诊断解决方案，适用于资源有限环境中的现场核酸检测和病原体监测。
