摘要
冬眠作为一种在低温环境下的生存策略，被认为对繁殖性能有显著影响。然而，关于这种相互作用背后的机制仍存在许多未解之谜。本研究采用超声波扫描技术来量化卵泡数量，并检测血浆中的神经递质和类固醇激素，以阐明冬眠期间（包括冬眠开始（OH）、深度冬眠（DH）和冬眠结束（EH）阶段）卵泡发育与内分泌波动之间的动态关系。研究结果表明，在冬眠开始之前卵泡发育周期就已经启动，冬眠结束后还会出现一个卵黄沉积的周期。此外，发现直径大于20毫米的卵泡（PF，接近成熟大小的卵泡）的数量与血浆中的GABA/谷氨酰胺浓度之间存在显著相关性。这强烈表明，维持接近成熟的卵泡可能与冬眠期间神经递质的波动有关。RNA-seq结果显示，PF中GABA受体的下调可能意味着神经递质反应性的降低，这一现象与冬眠时期相吻合。我们推测，这种现象可能有助于防止细胞过度增殖和凋亡，从而帮助卵泡在冬眠期间持续存在。MeRIP-seq的结果结合体外分子反应进一步表明，冬眠期间卵母细胞招募进入卵黄发生过程的抑制与M6A甲基化修饰有关。此外，相应的研究结果还表明，除了原始卵泡的启动和招募外，卵巢储备也可能受到冬眠深度的影响，这可能通过双链断裂（DSBs）和同源染色体在卵子发生过程中的配对等关键生物学事件来实现。
引言
冬眠物种在资源获取和代谢活动方面表现出显著的变化（Hrvatin等人，2020年），冬眠期间的基础代谢率可下降90%以上（Ruf和Geiser，2015年）。此外，在休眠状态下，大多数生理过程会暂停或暂时停止（Nespolo等人，2018年）。值得注意的是，已有证据表明冬眠与哺乳动物（Morrow等人，2016年）、鸟类（Goodenough等人，2017年）、爬行动物（Lin等人，2020年）、两栖动物（Roth等人，2010年）和无脊椎动物（Ansart等人，2002年）的繁殖性能之间存在相关性。数据表明，冷血动物的繁殖系统比哺乳动物更容易受到冬眠的严重影响（Liao等人，2023年）。非冬眠的蟾蜍卵母细胞即使在接受孕酮刺激后也无法发生生殖泡破裂（Tchou和Wang，1963年）。在冬眠期间，暴露于高温干扰下的卵母细胞中CDC2的积累会减少（Santana等人，2015年），这进一步阻碍了它们在高温越冬环境中的最终成熟（Kuang等人，2013年）。中国鳄鱼（Alligator sinensis）是一种一级保护动物，它在高纬度地区冬眠以度过严冬。冬眠期间，其代谢率显著降低。有研究表明，这种状态会影响其繁殖性能（Chen等人，2003年），表现为随后繁殖季节卵泡发育相关基因表达模式的紊乱（Lin等人，2020年）。然而，冬眠窗口期内繁殖性能的发育过程和内在分子机制仍不清楚。
卵生脊椎动物的繁殖能力取决于基于颜色和直径分类的严格分级的卵泡发育过程。作为鳄鱼的进化近亲，鸡的卵巢中含有处于不同发育阶段的卵泡，包括静止的白卵泡（RWF，<2毫米）、生长的白卵泡（GWF，2-6毫米）、小黄卵泡（SYF，6-8毫米）和排卵前卵泡（PF，9-12毫米）。对于卵生物种而言，卵泡发育主要受雌激素和孕酮等多种激素的复杂调控（Berenice Cruz-Cano等人，2023年）。此外，经典的神经递质系统，包括γ-氨基丁酸（GABA；Catalano等人，2005年）和谷氨酰胺（Zhang等人，2024年），也通过抗凋亡（Wang等人，2022年）和促性腺激素合成调控（Trudeau等人，2000年）与卵泡发育密切相关。例如，孕酮是由卵泡颗粒细胞（GCs）产生的关键激素，据报道它受到GABA的抑制（Gilfarb和Leuner，2022年）。在鱼类中，GABA还可能参与调节其他垂体激素的释放，包括促卵泡激素和生长激素（Popesku等人，2008年）。此外，来自成年金鱼（Neal-Perry等人，2014年）和啮齿动物（Martyniuk等人，2007年）的证据表明，NMDA受体介导的神经传导激活可以刺激LH的释放。更重要的是，GABA和谷氨酸都表现出季节性波动（Saunders和Santin，2024年）。然而，神经递质是否在冬眠物种的卵泡发育过程中起调节作用仍不清楚。
表观遗传机制通过基因-环境相互作用来调节真核生物的基因表达、发育和应激反应（Serre等人，2008年）。在冬眠期间，为了降低代谢率，需要通过翻译后修饰实现快速且可逆的转录和翻译抑制（Watts和Storey，2019年）。哺乳动物冬眠期间基因表达的调控机制，特别是表观遗传控制在协调整体转录抑制方面的作用，已在地松鼠的组织中得到记录，包括大脑、肝脏、肾脏、脂肪组织和消化器官（Morin和Storey，2009年）。例如，在肝脏中，HP-27基因内-161位置的CpG二核苷酸的低甲基化与冬眠期间的特定下调相关（Fujii等人，2006年）。此外，研究表明，在冬眠-觉醒周期中，肌细胞增强因子2的启动子区域的DNA甲基化会发生变化（Alvarado等人，2015年）。线粒体编码的呼吸链的过甲基化或低甲基化在调节代谢率下降过程中起着关键作用（Biggar和Li，2015年）。KMT活性的变化，由于赖氨酸甲基化的差异，在Trachemys scripta中的缺氧耐受性和Rana sylvatica的冷冻存活中也很重要（Wijenayake和Storey，2016年；Hawkins和Storey，2018年）。作为真核生物中最常见的mRNA表观遗传修饰（Gilbert等人，2016年；Zhao等人，2020年），N6-甲基腺苷（M6A）在女性生殖系统的多种生理和病理过程中起着关键作用（Zhang和Zhang，2023年；Li等人，2024年）。首次发现的M6A RNA甲基转移酶类似蛋白3（METTL3）可以利用S-腺苷甲硫氨酸催化RNA腺嘌呤的甲基化（Han等人，2022年）。METTL14与METTL3的结合不仅稳定，而且对RNA调控功能至关重要（Bokar等人，1997年；Liu等人，2014年）。METTL14作为催化亚基，而METTL3则为RNA识别和结合提供了关键的结构基础（Wang等人，2016a；Wang等人，2016b）。此外，Wilms肿瘤1相关蛋白在M6A甲基化过程中起着重要作用，对METTL3的定位也是必不可少的（Zhong等人，2008年）。此外，M6A在冬眠期间与繁殖性能相关的生理变化中的作用仍不清楚。
在本研究中，使用超声波扫描技术监测卵泡数量的动态变化以及血浆中神经递质和类固醇激素的变化，以描述冬眠期间繁殖性能与内分泌波动之间的关联。通过对卵泡进行组织学和转录组分析，阐明了卵泡发育的分子机制。最后，通过甲基化RNA免疫沉淀后测序（MeRIP-seq）比较卵巢，揭示了M6A甲基化修饰对冬眠期间卵巢的影响。
实验设计示意图
如补充图1所示，中国鳄鱼在9月开始禁食期，11月进入冬眠状态，1月进入深度冬眠，3月逐渐结束冬眠，5月进入交配季节，6月产卵。为了系统地探讨冬眠与中国鳄鱼繁殖性能之间的关联，选取了18只性成熟的雌性中国鳄鱼。
从不同冬眠阶段收集的不同表型的卵泡数量
如图1C所示，在不同直径的卵泡中，只有直径大于20毫米的卵泡数量明显多于退化的卵泡（P<0.01），这种差异在冬眠的三个阶段都存在。相关发现与哺乳动物中的现象相似，即在窦状卵泡之前的卵泡比主导卵泡更容易发生退化（Vitale等人，2002年；Matsuda等人，
讨论
在生殖和生物医学研究中，非侵入性超声检查已被用于评估多种卵生物种的卵巢卵泡活性和形态结构，包括龟类（Amiri等人，2023年）、鸟类（Sreesujatha等人，2016年）和鳄鱼（Lance等人，2009年）。迄今为止，尚未有研究使用B超技术监测具有冬眠习性的物种在冬眠过程中的卵泡发育。本研究揭示了……
结论
总之，本研究探讨了冬眠对中国鳄鱼卵泡发育的影响。研究重点分析了冬眠期间的激素、表观遗传和代谢变化，强调了神经递质和基因表达调控在繁殖系统中的作用，特别是M6A RNA甲基化对卵生物种繁殖结果的影响。
资助
我们感谢国家自然科学基金（NSFC）对本项目的资助，项目编号分别为32370542和32170525。
CRediT作者贡献声明
徐云璐：软件、方法学、研究。
王世：可视化、研究。
詹继祥：方法学、研究、形式分析。
李少帆：验证、软件、研究。
刘鹏：可视化、验证、软件、概念设计。
张远：可视化、软件。
周永康：资源获取。
文月：验证、项目管理、方法学。
吴晓冰：监督、资金获取。
聂海涛：撰写初稿、项目管理、资金争取。
声明
作者声明：在撰写本文过程中未使用任何生成式人工智能（AI）工具。
利益冲突声明
所有作者声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢广州Gene Denovo Biotechnology有限公司提供的测序平台和生物信息分析服务。
