摘要
雌激素相关受体（ERR）激动剂，如候选药物SLU-PP-332和SLU-PP-915，因其能够模拟运动引发的生理效应而被作为运动模拟剂进行研究。本研究旨在通过液相色谱-高分辨（串联）质谱（LC-HRMS/MS）对这两种泛ERR激动剂进行表征，并分析其通过人肝S9组分（S9 fraction）和人肝微粒体（HLMs）产生的体外代谢转化产物。
1 引言
雌激素相关受体（ERRs）作为孤儿受体，在能量稳态和脂质代谢中扮演重要角色，并与代谢性疾病或骨骼肌疾病等相关。尽管ERRs与雌激素受体（ERs）结构相似，但并不被其内源性激动剂激活。SLU-PP-332和SLU-PP-915是能靶向ERR所有三种亚型（ERRα、ERRβ和ERRγ）的新型激动剂。SLU-PP-332在动物模型中显示出能促进IIa型氧化骨骼肌纤维增加并提高运动耐力，而SLU-PP-915在体外和体内均表现出基因表达调节和激动活性。这些特性使其不仅有望用于治疗肥胖或代谢紊乱，也可能被滥用于体育兴奋剂。为了维护有效的反兴奋剂体系，有必要在这些化合物上市并被运动员获取之前进行充分的分析表征。将新物质纳入现有兴奋剂检测方法时，除原形化合物外，其代谢产物作为分析靶标往往能提供更长的检测窗口和更高的灵敏度。本研究提供了SLU-PP-332和SLU-PP-915的质谱表征，并深入研究了它们的体外代谢行为。
2 方法
2.1 化学品与试剂
SLU-PP-332购自Hycultec公司。SLU-PP-915及其氯代类似物SLU-PP-915-Cl（作为内标，IS）通过文献方法合成。其他化学试剂和生物材料（如HLMs、S9 fraction）均从商业渠道获得。
2.2 NMR光谱
使用Bruker Avance I 300和Bruker Avance III 499系统进行核磁共振（NMR）分析，以确认合成产物的结构。
2.3 合成
SLU-PP-915及其代谢物参考已知路线合成。以5-溴噻吩-2-甲酸为起始原料，与2-氟苯胺通过TBTU介导的酰胺化反应得到中间体，再与1,3-苯二硼酸通过Suzuki偶联反应得到目标产物SLU-PP-915。内标SLU-PP-915-Cl的合成方法类似，使用2-氯苯胺作为起始原料。代谢物M1（5-(3-羟苯基)噻吩-2-甲酸）、M3（5-(3-硼酸基苯基)噻吩-2-甲酸）和M4（N-(2-氟苯基)-5-(3-羟苯基)噻吩-2-甲酰胺）通过相应的化学反应（如氧化、水解）合成，其结构经NMR确认。
2.4 体外代谢实验
体外代谢实验参考并略微修改了Kuuranne等人的方案。使用HLMs和S9 fraction进行I相和II相代谢研究，并添加NADPH再生系统（NADPH reg system）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDGPA）等辅助因子。将化合物工作液与酶、辅因子在37°C下孵育24小时。同时设置不含酶的空白对照和不含底物的空白对照以验证结果。反应后使用冰乙腈终止，离心取上清，真空浓缩后复溶进样。
2.5 液相色谱-高分辨（串联）质谱（LC-HRMS/MS）
分析使用Thermo Fisher的Vanquish UHPLC系统耦合Orbitrap Exploris 480质谱仪。色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱。采用梯度洗脱，流动相为甲酸铵缓冲液（SLU-PP-332）或含0.1%甲酸的水溶液（SLU-PP-915系列）与含0.1%甲酸的乙腈。质谱采用加热电喷雾离子源（HESI），分别在正离子（SLU-PP-332）或负离子（SLU-PP-915系列）模式下运行。采集全扫描和并行反应监测（PRM）模式下的数据，碰撞能量为40%。
3 结果与讨论
3.1 参比物质的合成与质谱表征
SLU-PP-332在正离子模式下检测为[M+H]+(m/z 291.1142)。其MS2谱图中，m/z 121.0288（可能为腙键α-裂解产生）为最丰峰，m/z 171.0924（可能通过离子/中性复合物质子转移形成）及其进一步脱氨产生的m/z 154.0657也被观察到。另一个α-裂解（可能发生在酮基）产生m/z 197.0718。SLU-PP-915及其内标在负离子模式下进行分析，主要产生m/z 203.0345的碎片离子（源于酮基的α-裂解），该碎片可进一步失去H2O（18 u）或硼酸基团（44 u）产生m/z 185.0239和m/z 159.0276。
3.2 体外代谢转化
对于SLU-PP-332，共鉴定出9种代谢物，包括6种I相和3种II相结合物。I相代谢包括羟基化（M1a-b）、双羟基化（M2a-b）、双羟基化伴随还原（M3a-b）。II相代谢包括葡萄糖醛酸化（M4）、硫酸化（M5）以及羟基化后硫酸化（M6）。通过MS2谱图解析了代谢位点，例如M1a和M1b的羟基化分别发生在萘环和酚环上。M3a-b被推测为萘环发生环氧化水解生成二氢二醇类代谢物。
对于SLU-PP-915，共鉴定出7种代谢物，均为I相代谢产物。代谢途径包括酰胺水解、硼酸氧化、羟基化等，形成代谢物M1（酰胺水解+氧化）、M2（酰胺水解+氧化+羟基化）、M3（酰胺水解）、M4（氧化）、M5a-b（氧化+羟基化）和M6（羟基化）。值得注意的是，M1、M3、M4在酶空白中也有检出，提示存在非酶转化途径，但其仍可能作为体内代谢标志物。代谢物M1、M3、M4通过化学合成获得，其色谱和质谱行为与体外代谢产生的相应代谢物一致，证实了所推测的结构。所有代谢物的结构解析主要基于MS2碎片信息，但要精确定位代谢修饰位点，通常需要合成确证。
4 结论
本研究对具有潜在滥用风险的新型泛ERR激动剂SLU-PP-332和SLU-PP-915进行了全面的分析表征和体外代谢研究，鉴定并初步解析了它们的代谢产物，并为SLU-PP-915的三种关键代谢物提供了合成参比物质。这些结果为将此类物质纳入现有兴奋剂控制检测方法奠定了重要基础，有助于防范其非法使用。后续需要开展更复杂的体内代谢研究（如临床试验）以深入了解其真实代谢谱，确保在人体尿液样本中的有效检测。
