苯硼酸修饰的磁性珠子与DNA锚定的近红外AIEgen基超灵敏信号标签结合，用于基于Argonaute的生物传感

磁性纳米颗粒-苯硼酸复合物与聚集诱导发光探针联用实现金黄色葡萄球菌的高灵敏度检测，检测限低至13.74 CFU/mL，线性范围广达10²-10⁷ CFU/mL，适用于复杂样本分析。

彭学文|杨素芬|黄正章|牛峰|张和同|李一琦|韩亚婷|张彩阳|马洁梅|陈一平

华中农业大学化学学院，中国武汉430070

摘要

病原体长期以来对人类生命和环境安全构成了重大威胁，因此快速检测传染性病原体对于减轻这些风险至关重要。然而，生物传感器的实际应用常常受到复杂样品基质和有限灵敏度的阻碍。为了解决这些问题，我们制备了用苯硼酸（PBA）功能化的磁性纳米颗粒（MNP-PBA），该传感器能够在20分钟内高效且无损地从复杂样品中捕获金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称S. aureus），在10^8 CFU/mL的浓度下实现了92.21%的捕获率。此外，引入了一种基于聚集诱导发射的荧光团TTQ-PF6作为检测探针。TTQ-PF6具有较大的斯托克斯位移（265 nm）、强烈的红色荧光以及出色的抗光漂白能力——分别比罗丹明X（Rhodamine X）提高了5.67倍和9.40倍。此外，TTQ-PF6允许将多种荧光团共轭到单条DNA链上，而无需使用化学试剂。MNP-PBA与红色发射的TTQ-PF6的结合使得细菌检测能够有效抵抗基质干扰，实现了S. aureus从10^2到10^7 CFU/mL的宽检测线性范围，检测限低至13.74 CFU/mL。总体而言，这项工作为复杂环境中的病原体检测提供了一个强大而高效的平台。

引言

病原菌广泛分布于各种环境中，对人类健康构成严重威胁（Hou等人，2025年）。哺乳动物肠道菌群失衡与许多疾病的发生和发展密切相关，包括炎症性肠病、腹泻、糖尿病和肺炎（Brezden等人，2016年；Jimbo等人，2017年；Salah等人，2022年；Wang等人，2025c年）。此外，大多数食物中毒病例是由病原菌引起的（Feng等人，2023年；Wang等人，2024b年）。因此，自现代医学诞生以来，敏感且特异性的病原菌检测对于预防传染病传播和治疗相关疾病至关重要（Sohrabi等人，2022年；Zhu等人，2017年）。传统的病原菌检测方法主要包括基于培养的检测方法和基于核酸的技术（Váradi等人，2017年；Xia等人，2025年）。尽管平板计数方法可靠且准确，但其劳动密集型和耗时的特性限制了其实用性（Wang等人，2025a年；Wang等人）。聚合酶链反应（PCR）是目前流行的技术，但扩增过程需要严格的温度控制，这增加了操作的复杂性（Liu等人，2024b年；Lu等人，2024年）。此外，现有方法难以检测低丰度的病原菌，并且容易受到复杂样品基质的干扰（Sohrabi等人，2022年）。因此，有效的样品预处理和高灵敏度的荧光探针是提高病原菌筛查性能的关键因素。

传统的荧光团如6-羧基荧光素（FAM）、花青素3（Cy3）和罗丹明X（ROX）通常受到光稳定性的限制，这可能损害检测的灵敏度和稳定性（Lee等人，2021年；Liu等人，2024a年）。为了克服这些问题，随着发光材料的快速发展，各种荧光探针（如新设计的有机染料、量子点、稀土掺杂的发光纳米颗粒和金属纳米簇）逐渐出现，并在细菌检测中显示出巨大潜力（Huang等人，2025年；Levchenko等人，2017年；Ren等人，2024年；Zhou等人，2022年）。但这些探针在引入分析物或高浓度时容易聚集，导致荧光信号减弱（由于聚集引起的猝灭效应，ACQ），从而扭曲检测结果（Hu等人，2023年；Lee等人，2023年；Zhang等人，2025年）。相比之下，基于聚集诱导发射的荧光团（AIEgens）提供了一个有前景的替代方案（Yan等人，2025年）。AIEgens具有富含旋转子和振动子的扭曲分子结构（Lee等人，2023年）。当它们聚集时，分子内运动的限制抑制了非辐射衰减，从而显著增强了荧光（Feng等人，2025年；Wang等人，2025b年）。这一独特属性使AIEgens成为生物传感的理想选择（He等人，2024年；Mao和Liu，2021年）。此外，为了避免复杂样品基质对传感性能的干扰，迫切需要AIEgens具有较大的斯托克斯位移，并能够有效分离目标信号和噪声。

基于这种情况，我们开发了一种使用苯硼酸（PBA）修饰的磁性纳米颗粒（MNP-PBA）的富集材料。MNP-PBA能够高效且无损地富集金黄色葡萄球菌（S. aureus），即使在细菌浓度高达10^8 CFU/mL的情况下也能保持92.21%的捕获率（图1A）。随后，合成了一种近红外（NIR）TTQ-PF6 AIEgen，并利用其离子两亲性特性将其改造成DNA荧光探针。由于TTQ-PF6具有较大的斯托克斯位移和NIR特性，该探针显示出显著降低的背景噪声、更高的荧光强度和优于ROX的光稳定性（图1B）。通过整合MNP-PBA和TTQ-PF6，开发了一种基于嗜热丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Argonaute（CbAgo）的生物传感器。MNP-PBA捕获S. aureus，然后特异性地与适配体结合，释放燃料链。通过非酶促核酸电路生成大量DNA链，激活CbAgo切割预先组装在MNP上的TTQ-PF6修饰探针，从而将荧光片段释放到溶液中。通过测量磁分离后的荧光强度来实现S. aureus的定量。这种生物传感器消除了核酸提取和精确温度控制的需求，同时实现了超越传统qPCR的灵敏度（图1C）。该设计确保了在复杂基质中高度敏感地检测病原体，为生态系统稳定性、食品安全和公共卫生提供了强大的工具。

材料

试剂级化学品（Tris-HCl、KCl、NaCl、MgCl2、MnCl2和(NH4)2S2O8）从上海的中医药化工有限公司购买，无需进一步纯化。对氨基苯硼酸盐酸盐、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠（NHS）从上海的Aladdin公司购买。SYTO 9/ Pi Live / Dead细菌双重染色试剂盒从上海茂康生物科技有限公司购买。

S. aureus富集材料的构建

食品基质的复杂性严重影响了S. aureus的检测性能。苯硼酸（PBA）通过其独特的结构解决了这一问题：sp2杂化的硼原子具有空的p轨道，使其成为强路易斯酸，可以接受电子对。这使得PBA能够通过亲核加成与S. aureus细胞壁中的肽聚糖糖环或脂壁酸中的顺式二醇对相互作用，从而形成稳定的复合物

结论

总之，在基于MNP-PBA的S. aureus捕获材料的基础上，开发了一种EAT-CbAgo生物传感器。MNP-PBA捕获平台在20分钟内实现了92.91%的捕获效率。然后，作为生物传感器中的近红外探针的TTQ-PF6具有较大的斯托克斯位移（265 nm）、高荧光强度和优异的抗光漂白能力（比ROX提高了5.67倍和9.40倍），使得生物传感器能够在10^2到10^7 CFU/mL的范围内实现宽线性检测范围

CRediT作者贡献声明

李一琦：研究、数据管理、概念构思。牛峰：撰写——审稿与编辑、可视化、方法学、研究。张和同：研究、数据分析。黄正章：监督、资源管理、项目管理、方法学、数据管理。杨素芬：资源管理、数据分析。彭学文：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、概念构思。马洁梅：

未引用参考文献

Wang等人，

注释

作者声明没有竞争利益。

利益冲突声明

☒ 作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32572677）和国家重点研发计划（2022YFF0607900）的支持。