在条纹跳蚤甲（Phyllotreta striolata）中，一种影响RNA干扰（RNAi）效率的双链核糖核酸酶的鉴定及其功能分析

RNA干扰生物农药在十字花科害虫 striped flea beetle（Phyllotreta striolata）中应用的基础研究，发现其肠道富含的降解酶基因PsdsRNase调控dsRNA稳定性及RNAi效率，通过基因敲除和体外实验验证了该酶对dsRNA降解的作用机制，为提高RNAi防治效果提供理论依据。

陈梦丽|陈凯婷|陈国兴|陈培彤|陈东平|钱家丽|朱国年|徐展毅|闫茹

中国浙江省农林大学高级农业科学学院，作物病原体和昆虫生物学与生态调控浙江省重点实验室，杭州311300

摘要

基于RNA干扰的生物农药被认为是第三代农药革命，为解决传统化学农药过度使用导致的抗性发展、毒理学风险和环境污染问题提供了可持续的解决方案。Phyllotreta striolata是一种主要的十字花科作物害虫，是开发低dsRNA需求和高实验可行性的RNAi控制策略的理想模型。然而，P. striolata中核酸酶介导的dsRNA降解的分子机制尚未明确，这成为实现强大RNAi效应的关键障碍。通过生物信息学分析和同源序列比对，我们鉴定并表征了P. striolata成虫肠道中富集的一种核酸酶基因。凝胶电泳实验表明，异源表达并纯化的重组PsdsRNase蛋白具有快速的dsRNA降解活性。生化性质分析显示，dsRNA降解的最佳条件为碱性环境（pH=9）、低浓度Mg²⁺（1 mM）以及35°C的温度。随后，我们通过敲低PsdsRNase基因来测量其在体内的dsRNA降解作用，发现沉默后的成虫肠道腔内的核酸酶活性短暂下降。此外，预沉默PsdsRNase后，PsDre4 mRNA水平降低了58.71%，死亡率增加了20%以上。我们的发现揭示了P. striolata中dsRNA降解的分子基础，并为通过调节核酸酶活性提高RNAi效率提供了理论依据。

引言

条纹跳甲Phyllotreta striolata（Fabricius, 1803）（鞘翅目：叶甲科）是全球最具破坏性的十字花科蔬菜害虫之一（Rather等人，2017；Soroka等人，2018；Zhang等人，2000）。成虫和幼虫分别取食栽培和野生芸苔科植物的叶片和根部，导致作物生长受阻、产量减少（Liu等人，2018；Soroka等人，2018；Weijian，2002）。目前，广泛喷洒杀虫剂是控制P. striolata的主要有效方法，但长期大量使用农药已逐渐导致抗性加速产生，并对人类和环境健康造成严重危害（Feng等人，2000；Liu等人，2018；Turnock和Turnbull，1994；Zhou和Wu，2004）。迫切需要针对这种危害极大的农业害虫寻找替代管理方法。

RNA干扰（RNAi）是真核生物中高度保守的转录后基因沉默机制（Dang等人，2011；Nicolás和Ruiz-Vázquez，2013；Song等人，2021；Zhao和Guo，2022）。在RNAi途径中，内源性或外源性的双链RNA（dsRNA）可以被加工成18-30个核苷酸的小干扰RNA（siRNA），并招募到RNA诱导的沉默复合体中，从而特异性降解同源mRNA（Wilson和Doudna，2013）。自从在Caenorhabditis elegans中首次报道dsRNA引发的RNAi以来，它已成为探索基因功能的强大工具，并为害虫管理提供了重要策略（Bellés，2010；Huvenne和Smagghe，2010；Joga等人，2016）。然而，不同昆虫的RNAi效率差异显著，例如大多数直翅目和鞘翅目昆虫通常表现出高效的RNAi反应（Scott等人，2013；Swevers等人，2013），而鳞翅目、双翅目和半翅目的RNAi效率则变化较大（Joga等人，2016；Terenius等人，2011；Whyard等人，2009）。许多生物学因素被认为会限制昆虫的RNAi反应，包括核酸酶活性引起的dsRNA降解、dsRNA吸收不良、核心RNAi机制缺陷以及沉默RNA分子的系统传播受阻（Cooper等人，2019）。

双链核糖核酸酶（dsRNases）属于DNA/RNA非特异性内切酶（NUC）超家族，被认为是dsRNA不稳定的关键因素。自从在Bombyx mori的消化液中首次鉴定并表征了dsRNase（Arimatsu等人，2007a；Arimatsu等人，2007b）以来，在鞘翅目、半翅目、鳞翅目和直翅目中都观察到了dsRNases的降解活性（Cooper等人，2019）。作为RNAi效率的重要障碍，许多昆虫物种的中肠液中发现了dsRNases，如Leptinotarsa decemlineata和Ostrinia nubilalis（Cooper等人，2020；Spit等人，2017）。此外，dsRNases也被发现在Manduca sexta的血淋巴（Garbutt等人，2013）和Lygus lineolaris的唾液中具有活性（Allen和Walker，2012）。敲低dsRNase基因后，Locusta migratoria和Ostrinia furnacalis的RNAi反应增强（Guan等人，2018；Song等人，2017）。多项研究表明P. striolata具有强烈的RNAi反应，这使得基于RNAi的农药可用于控制P. striolata的侵害。有趣的是，先前的研究（Chen等人，2022；Guo等人，2023）发现，dsRNA注射比口服给药在P. striolata中更有效，可能是由于dsRNases在dsRNA吸收过程中对其进行了降解。然而，关于dsRNases的信息有限，这成为开发用于控制P. striolata的RNAi技术的主要障碍。

在本研究中，成功鉴定了P. striolata中的一种dsRNase基因PsdsRNase，并通过异源表达纯化的PsdsRNase研究了其生化性质。此外，我们抑制了PsdsRNase的表达，以评估该核酸酶与dsRNA在体外中肠液中的相互作用。然后进行了“RNAi对RNAi”的实验，以分析PsdsRNase对P. striolata中RNAi反应的影响。我们的发现表明PsdsRNase是调节P. striolata中dsRNA稳定性和RNAi敏感性的关键因素。

实验部分

昆虫采集与饲养

本实验中使用的P. striolata成虫来自中国浙江省金华市的Nuantian有机农场（119.5°E，25°N）。它们在25°C、75%相对湿度和95%土壤湿度条件下，以及12小时光照/12小时黑暗的周期中，以新鲜的Brassica juncea cv. Bau-Sin植物为食进行饲养。

PsdsRNase的鉴定与表征

通过使用Tribolium castaneum的dsRNase（XP_970494.1）作为查询序列，对P. striolata的转录组数据库进行了BLAST搜索，获得了PsdsRNase的核苷酸序列。

P. striolata中dsRNA降解核酸酶的特性

PsdsRNase的开放阅读框（ORF）包含1212个核苷酸，编码403个氨基酸残基。预测PsdsRNase蛋白包含一个16个氨基酸的信号肽和一个内切酶NS结构域（图1）。多物种dsRNase蛋白的比对结果显示，与六个活性位点、三个底物结合位点和一个Mg²⁺结合位点相关的关键氨基酸在不同昆虫物种中是保守的（图1）。系统发育树（图S1）清楚地显示了PsdsRNase的特征。

讨论

由于化学农药的过度使用引发了环境污染、农产品安全和害虫抗性等一系列问题，基于RNAi的生物农药作为害虫管理的潜在策略受到了广泛关注（Rank和Koch，2021；Tudi等人，2021）。然而，在不同昆虫目中观察到从dsRNA注射到口服给药的过程中，RNAi效果有所降低，包括我们研究的P. striolata（Chen等人，2022；Luo等人，2013；

伦理要求遵守情况

在本研究中使用的昆虫物种方面，我们遵循了所有关于实验动物护理和使用的机构和国家标准。本文不包含任何涉及人类的研究。

CRediT作者贡献声明

陈梦丽：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，方法学，实验设计，资金获取，数据分析，概念化。陈凯婷：撰写——审稿与编辑，数据可视化，软件应用，方法学，实验设计，数据分析。陈国兴：撰写——审稿与编辑，软件应用，方法学。陈培彤：撰写——审稿与编辑，方法学，数据分析。陈东平：软件应用，方法学，数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了浙江农林大学科学研究与发展人才启动项目（资助编号2021LFR015，授予MC）、国家自然科学基金（资助编号32300447，授予RY）、浙江省自然科学基金（资助编号LQ24C040001，授予RY）以及CPSF博士后奖学金计划（资助编号GZC20252512，授予ZX）的支持。