硫代高异黄酮类化合物：治疗新生血管性眼病的新型抗血管生成与抗炎候选药物

本文系统研究了硫代高异黄酮类化合物（3-benzylidene thiochroman-4-ones）作为潜在治疗新生血管性眼病（如湿性年龄相关性黄斑变性wAMD）的先导化合物。研究通过三步法合成了一系列硫代类似物，并评估了其对内皮细胞（HRECs）的选择性抗增殖活性（GI50低至3.07 µM）、在基质胶（Matrigel）实验中抑制血管生成的能力（化合物10在10 µM下抑制率达56.41%），以及对环氧合酶（COX-II/COX-I）的抑制活性。结果表明，该类化合物具有显著的抗血管生成活性和一定的抗炎潜力，且对非内皮细胞（ARPE-19）毒性低，展现出良好的开发前景。

引言

新生血管性眼病，如湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），以眼内异常、脆弱血管的过度形成为特征。当前主要疗法是使用靶向血管内皮生长因子（VEGF）的生物制剂（如贝伐珠单抗、雷珠单抗、阿柏西普），但这些药物价格昂贵、需玻璃体内注射，且约30%的wAMD患者对其产生耐药性。此外，长期氧化损伤导致的炎症在wAMD的发展中起着关键作用。因此，开发一种能同时靶向血管生成和炎症的小分子药物，将极大改善wAMD等疾病的治疗选择。

高异黄酮类化合物（Homoisoflavonoids）是一类天然存在的C-16黄酮亚类，主要从天门冬科、豆科等植物中分离得到，具有包括抗炎和抗血管生成在内的多种生物活性。天然高异黄酮类化合物克瑞玛斯特拉酮（cremastranone）在体外和体内均显示出良好的血管生成抑制作用，激发了人们对天然和合成高异黄酮作为潜在眼病治疗药物的研究兴趣。研究表明，C-3和C-9之间的双键以及B环引入大位阻基团可增强其活性。

硫代色满-4-酮（Thiochroman-4-one）衍生物，即天然高异黄酮（色满-4-酮）的硫类似物，因其抗菌、细胞毒性和抗利什曼虫活性而受到关注。本研究旨在探讨在高异黄酮C环中用硫原子取代氧原子对其抗血管生成和抗炎特性的影响，并研究引入卤素（如溴原子）和硝基等吸电子基团的效果，同时保持C-3和C-9之间的双键。

结果与讨论

化学合成

研究通过三步法合成了10种3-亚苄基硫代色满-4-酮类化合物（4–13）。首先，取代苯硫酚与3-氯丙酸在氢氧化钠溶液中反应生成苯硫基丙酸；其次，在多磷酸（PPA）作用下环化形成硫代色满酮；最后，与各种取代苯甲醛在浓硫酸和冰醋酸催化下进行Claisen–Schmidt缩合得到最终产物。该酸催化方法比碱催化方法更有效。引入溴原子是药物化学中常见的策略，因其可形成卤键、增加脂溶性，有助于跨膜运输。化合物5的晶体结构通过单晶X射线衍射确认，分子呈平面状，有利于分子堆叠。

药理学研究

抗增殖活性（alamarBlue法）

合成的硫代高异黄酮类似物（4–13，除12外）对人视网膜内皮细胞（HRECs）表现出强烈的选择性抗增殖活性，而对视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）的GI₅₀值均大于100 µM，显示出低毒性。其中，化合物10（(3Z)-3-[(3-溴苯基)亚甲基]-6-甲氧基-2,3-二氢-4H-1-苯并硫代吡喃-4-酮）活性最强，对HRECs的GI₅₀为3.07 µM。化合物12对两种细胞均无毒性。这些硫类似物的活性与具有C-3/C-9双键的合成氧类似物（GI₅₀0.21–3.60 µM）相当。

抗血管生成活性

治疗窗口确定（中性红法）

选取活性不同的6种化合物（4, 5, 6, 10, 11, 13）评估其对脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞毒性。结果表明，在1、5、10 µM浓度下，所有测试化合物均无细胞毒性；浓度≥50 µM时则表现出显著毒性。因此，选择5 µM和10 µM作为后续基质胶实验的测试浓度。

管腔形成抑制测定（Matrigel法）

在基质胶管腔形成实验中，化合物4、6、10、11、13在10 µM浓度下能显著减少HUVECs形成的网状结构（meshes）数量。化合物10效果最为突出，在5 µM和10 µM浓度下，网状数量分别减少38.79%和56.41%。化合物6和13在10 µM浓度下也分别减少27.6%和24.3%的网状数量。此外，只有化合物10在两种浓度下均能显著降低总分支长度（Tot. Branching Length）。值得注意的是，化合物6、10、13在A环的R₁位点均含有甲氧基（-OCH₃），提示该基团可能增强抗血管生成活性。化合物5在两个测试浓度下均未显示显著抑制效果。

COX抑制活性

环氧合酶（COX）是炎症和血管生成过程中的关键酶，选择性抑制COX-II优于COX-I是理想的抗炎策略。测试的6种化合物（4, 5, 6, 7, 8, 10）在4.35 nM和2.18 nM浓度下对COX-I和COX-II的抑制活性表明，化合物7对COX-II的抑制率最高（22.7%, 4.35 nM），但缺乏选择性（对COX-I抑制率为31.3%）。化合物5对COX-I的抑制率最高（34.3%, 4.35 nM）。总体而言，这些硫代高异黄酮类似物显示出一定的抗炎潜力，但对COX-II over COX-I的选择性有限。

结论

本研究成功合成了十种硫代高异黄酮类似物。其中九种活性化合物对人视网膜内皮细胞（HRECs）表现出强效且选择性的抗增殖活性，同时对非内皮细胞（ARPE-19）毒性低，这与具有C-3/C-9双键的合成氧类似物效果相当。在非细胞毒性浓度下（5 µM和10 µM），多个化合物能在基质胶实验中有效抑制HUVECs的管腔形成，表明其具有抗血管生成能力。此外，部分化合物还显示出对COX酶的抑制活性。其对内皮细胞的选择性、抗血管生成能力以及COX抑制活性的结合，使得这类3-亚苄基硫代色满-4-酮化合物成为治疗湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）及相关新生血管性眼病的具有良好开发前景的候选药物。

实验部分

化合物通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）、红外光谱（IR）和X射线晶体学进行了表征。抗增殖实验使用alamarBlue法检测对HRECs和ARPE-19细胞的影响。细胞毒性使用中性红法测定。抗血管生成活性通过HUVECs在基质胶上的管腔形成实验评估。COX抑制活性使用商业检测试剂盒（Cayman Chemicals）测定。所有数据均进行统计学分析。