多管齐下的策略用于重新激活CD8+ T细胞的细胞毒性，以对抗乳腺癌

胸腺素α1（Tα1）通过激活CD8+ T细胞增强乳腺癌细胞凋亡和增殖抑制，同时减轻耗竭表型（PD-1/TIM-3/LAG-3表达下降），转录组分析验证其通过TLR9/2信号通路调控抗原呈递和细胞毒性程序。

斯密蒂·米什拉（Smriti Mishra）|高兰·特兰格（Gaurang Telang）|阿努拉格·苏雷什巴布（Anurag Sureshbabu）|萨姆鲁迪·库尔卡尼（Samruddhi Kulkarni）|森蒂尔·泰亚格拉詹（Senthil Thayagrajan）|A.W 桑托什·库马尔（A.W Santhosh Kumar）|拉杰什里·辛格（Rajshri Singh）

阿米蒂生物技术学院（Amity Institute of Biotechnology），阿米蒂大学（Amity University），马哈拉施特拉邦，孟买-浦那高速公路（Mumbai-Pune Expressway），巴坦（Bhatan），索马特内邮编（Post Somathne），潘维尔（Panvel）410206，印度

摘要

胸腺素α1（Tα1）是一种内源性胸腺肽，可通过激活T细胞、树突状细胞和先天免疫途径来增强免疫能力。然而，它对乳腺癌中CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫的直接影响仍不清楚。在本研究中，从10名健康捐赠者的外周血中分离出的CD8⁺ T细胞在未刺激、CD3/CD28刺激、Tα1处理或耗竭恢复条件下进行培养，以评估其对MDA-MB-231乳腺癌细胞和CD44⁺癌干细胞样细胞（CD44⁺ CSC样细胞）的细胞毒性作用。Tα1显著增强了CD8⁺ T细胞介导的细胞凋亡，抑制了肿瘤细胞增殖，并增加了颗粒酶B的分泌，其效果超过了单独使用CD3/CD28刺激的效果。在耗竭的T细胞中，Tα1部分恢复了效应功能，并降低了PD-1、TIM-3和LAG-3的表达。使用紧凑的四基因Tα1反应指数（Tα1-RI：TLR9、TLR2、IRF1、NLRC5）对TCGA-BRCA数据集（n = 1,112）进行的转录组分析证实了其与抗原呈递和细胞毒性程序的正相关关系，并在单细胞数据集中富集了CD8样T细胞。总体而言，这些发现表明Tα1能够增强CD8⁺ T细胞的细胞毒性，同时缓解其耗竭状态，支持其作为改善乳腺癌免疫监视的辅助免疫调节剂的潜力。

引言

免疫系统在肿瘤监视和进展中起着关键作用。它由一系列细胞和细胞因子组成，这些细胞和细胞因子协同作用以抵御感染并抑制肿瘤发展。其中，CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）是诱导受感染和恶性细胞凋亡的关键效应器。早期观察到CD8⁺ T细胞渗入肿瘤微环境的现象被称为“地狱之流悖论”（hellstrom paradox），即尽管肿瘤被CD8⁺ T细胞识别，但它们仍然会继续发展[1]。肿瘤细胞利用多种机制逃避免疫反应，包括上调免疫检查点分子（如CTLA-4、PD-L1、TIM-3和LAG-3）以及下调肿瘤相关抗原。因此，已经广泛研究了多种免疫治疗策略，该领域不断取得快速进展[2]。

乳腺癌是一种重大的全球健康负担，通常被认为是一种相对“沉默”的癌症，可用的免疫治疗策略较少[3]。然而，基于细胞的免疫疗法在乳腺癌中的开发和临床应用仍然相对较新且未得到充分探索，这突显了这一领域的重要研究方向[4]。

triple-negative乳腺癌（TNBC）中的癌干细胞的存在是这一挑战的核心，这类癌细胞对传统疗法具有抗性，会驱动肿瘤复发，主动调节肿瘤免疫微环境以促进免疫逃逸，使肿瘤更具侵袭性。这些特性限制了现有免疫疗法的有效性，突显了免疫系统（特别是CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞）在决定疾病结果中的关键作用[5]、[6]。

鉴于临床紧迫性和免疫抵抗的双重挑战，乳腺癌成为评估新型免疫调节策略的理想模型。在这种情况下，胸腺素α1（Tα1）是一种已知可以增强T细胞激活、细胞因子分泌和免疫稳态的胸腺肽，显示出恢复抗肿瘤免疫的潜力[7]。Tα1是一种天然存在的28个氨基酸组成的胸腺肽，具有明确的免疫调节特性。它可以增强T细胞激活和分化，促进关键细胞因子的分泌，并调节树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞的活性[8]、[9]。Tα1已在病毒感染（包括乙型和丙型肝炎）、败血症和免疫缺陷的背景下得到广泛研究[10]。此外，它还被探索作为癌症的辅助疗法，其增强抗肿瘤免疫的能力受到了越来越多的关注。尽管有证据表明Tα1可以增强T细胞反应，但其在乳腺癌中直接增强CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤免疫的作用仍不明确。在本研究中，我们探讨了Tα1是否通过促进细胞凋亡、控制增殖和效应功能来增强CD8⁺ T细胞对乳腺癌细胞和CD44⁺癌干细胞样细胞（CD44⁺ CSC样细胞）的细胞毒性。

章节片段

供体样本采集和外周血单核细胞分离

外周血单核细胞（PBMCs）由印度的浦那BioRadius Therapeutic Research Pvt. Ltd.公司提供，该公司是一家经过认证的临床研究机构（详细信息见补充材料）。供体为健康成人，且在献血时没有已知的自身免疫疾病、慢性炎症性疾病、恶性肿瘤或活动性感染。排除以下情况的供体：

Tα1增强CD8⁺ T细胞介导的乳腺癌细胞和CD44⁺ CSC样细胞的细胞凋亡

我们首先研究了胸腺素α1（Tα1）是否能够增强CD8⁺ T细胞诱导乳腺癌细胞凋亡的能力。采用标准化的分选策略，通过Annexin V/PI染色来识别CD44⁺肿瘤细胞并量化凋亡比例（图1A）。代表性流式细胞术图表显示，与未刺激对照组相比，CD3/CD28刺激增加了MDA-MB-231细胞的凋亡，而在Tα1存在的情况下这种效应进一步增强（图1B）。

讨论

胸腺素α1 [Tα1] 越来越被认为是一种多功能的免疫调节肽，但其对乳腺癌中CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤反应的直接影响尚未得到系统研究。在这里，我们发现Tα1增强了CD8⁺ T细胞的多个方面功能，包括增强乳腺癌细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、增加效应分子的释放以及缓解细胞耗竭。这些效应不仅限于MDA-MB-231细胞

伦理声明

本研究中使用的外周血单核细胞（PBMCs）来自印度的浦那BioRadius Therapeutic Research Pvt. Ltd.公司，这些细胞来自已签署知情同意书的匿名健康供体，符合机构伦理政策。本研究未涉及任何人类或动物实验。

CRediT作者贡献声明

斯密蒂·米什拉（Smriti Mishra）：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。高兰·特兰格（Gaurang Telang）：撰写——审阅与编辑、可视化、软件应用、数据分析。阿努拉格·苏雷什巴布（Anurag Sureshbabu）：撰写——审阅与编辑、验证、软件应用。萨姆鲁迪·库尔卡尼（Samruddhi Kulkarni）：撰写——审阅与编辑、研究、数据分析。森蒂尔·泰亚格拉詹（Senthil Thayagrajan）：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。A.W 桑托什·库马尔（A.W Santhosh Kumar）：

资助

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。所有实验工作和分析均使用印度浦那BioRadius Therapeutic Research Pvt. Ltd.公司和马哈拉施特拉邦阿米蒂大学提供的机构资源和实验室设施进行。

利益冲突声明作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者衷心感谢印度浦那BioRadius Therapeutic Research Pvt. Ltd.公司在样本处理和分析过程中提供的实验室设施和技术支持。计算分析使用了来自癌症基因组图谱（TCGA）和吴及其同事的单细胞乳腺癌图谱的公开数据集。