由于酶具有高催化效率、强特异性、环境友好性和温和的反应条件，它们已被广泛应用于食品、医药、化学工程和生物燃料等领域[1]。然而，自由态酶的工业潜力受到其对外部条件敏感、稳定性差以及难以从产物中回收和分离的限制[2][3]。为了提高酶的工业应用性，酶固定化技术通过将自由态酶锚定在固体载体上，显著提高了酶的稳定性，实现了高效回收和再利用，并简化了下游分离过程，有效克服了自由态酶在实际应用中的主要瓶颈[4]。固定化载体的物理化学性质（如比表面积、表面官能团、机械强度、生物相容性和分离便捷性）直接决定了固定化酶的催化效率、稳定性和操作性能[5]。因此，开发新型高效的固定化载体仍是酶工程领域的前沿和核心挑战。
在各种载体材料中，磁性纳米颗粒（MNPs），特别是磁铁矿（Fe₃O₄）纳米颗粒，由于其独特的性质（如超顺磁性和表面多功能性）而具有显著优势[6][7]。Fe₃O₄纳米颗粒的核心优势在于其出色的磁分离能力，在外加磁场作用下可实现快速有效的固液分离[8]，这完全避免了传统离心或过滤方法中耗时、效率低下以及酶失活的问题，大大提高了操作效率和成本效益。其次，它们的纳米级尺寸提供了较大的比表面积，增加了酶的负载能力，同时保持了高催化活性[9]。磁铁矿纳米颗粒易于表面功能化（例如硅烷化、氨基化、羧基化），使其易于进行各种化学修饰，为构建稳定高效的酶-载体结合界面提供了多种可能性[10]。此外，它们优异的生物相容性有助于保持酶活性并减少传质限制[11][12]。固定在磁铁矿纳米颗粒上的酶通常表现出优异的再利用性，活性损失最小，便于大规模商业化应用[13]。鉴于这些独特优势，磁铁矿纳米颗粒越来越多地被用于各种酶的固定化，包括α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40），这是一种关键的糖苷水解酶[14]。
α-L-鼠李糖苷酶能够特异性地水解末端α-1,2或α-1,6连接的鼠李糖基团，在食品加工（例如抑制柑橘汁中的苦味、提升葡萄酒香气）、制药和生物转化（例如修改天然产物以生成高价值化合物）等领域具有巨大的应用潜力[15][16][17][18][19][20]。该酶的一个关键应用是将柚皮苷（柑橘加工副产物中含量丰富但味道极苦的成分）催化转化为经济价值较高的普鲁宁[21][22][23]。作为黄酮苷类化合物，普鲁宁去除了鼠李糖基团，相比柚皮苷具有更好的溶解性和更强的生物活性，如抗氧化、抗癌和抗糖尿病作用[24][25]。然而，α-L-鼠李糖酶的实际应用受到其固有缺陷的限制，包括稳定性差、回收和再利用困难以及产物分离问题，这些因素阻碍了其大规模应用和经济效益[27]。因此，人们采用了多种纳米材料来固定α-L-鼠李糖酶，如Fe₃O₄@氧化石墨烯[28]、磁性颗粒Fe₃O₄-SiO₂-NH₂-Cellu-ZIF8 (FSNcZ8)[19]、磁性金属有机框架（MOFs）[29]、NaY沸石[30]、多壁碳纳米管[31]和石墨烯[32]等，以克服上述缺点。尽管之前已有基于磁性纳米颗粒的α-L-鼠李糖酶固定化研究，但大多数报道的系统需要复杂的多步骤表面修饰。例如，Fe₃O₄-SiO₂-NH₂-Cellu-ZIF8载体需要硅涂层、胺功能化、纤维素接枝和原位ZIF-8生长[19]；Fe₃O₄@氧化石墨烯复合材料和磁性MOFs通常涉及异质组装和额外的表面工程步骤[28][29]。这些过程往往复杂且耗时，可能会引入扩散障碍或结构不稳定。相比之下，本研究描述了一种更简单高效的固定化策略，即通过EDC/NHS介导的直接共价偶联将酶固定在裸露的Fe₃O₄纳米颗粒上，从而简化了合成过程，缩短了制备时间，并减少了潜在的结构复杂性。
在我们之前的研究中，通过高通量从头测序结合计算机模拟搜索催化关键基序的组合策略，从人类粪便宏基因组中成功筛选出了三种新型细菌α-L-鼠李糖苷酶（HFM-RhaA、HFM-RhaB和HFM-RhaC）[33]。HFM-RhaA能够高效地将柚皮苷转化为普鲁宁[33]，显示出较高的转化速率（k_cat，25.91 s⁻¹）和催化效率（k_cat/Km，13,512 s⁻¹ M⁻¹）[18]。然而，HFM-RhaA的稳定性极低，半失活温度T₅₀为34.5°C[33]。为了提高HFM-RhaA的稳定性并促进其再利用，本研究旨在利用EDC/NHS偶联化学方法开发一种基于磁铁矿纳米颗粒的简便固定化策略。优化了固定化参数，包括酶用量、活化时间、固定化时间、固定化温度和pH值。通过透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）和超导量子干涉装置（SQUID）对固定化酶Fe₃O₄-Rha进行了表征，并系统研究了其在柚皮苷转化中的最佳温度、pH值和有机溶剂耐受性。
