1 引言
抽动秽语综合征(Tourette Syndrome, TS)是一种复杂的神经发育障碍，其特征是童年期起病的持续性运动性和发声性抽动。该病影响约1%的普通人群，男女比例约为3-4:1。TS的病因是多因素的，涉及遗传、表观遗传和环境因素之间的动态相互作用。双胞胎和家庭研究支持其具有强烈的遗传性成分，并表明TS属于具有最高非孟德尔遗传的神经发育障碍之一。
新一代测序技术，特别是全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)，极大地增强了对TS遗传结构的理解，使识别出破坏关键神经发育途径的de novo de novo CELSR3 WWC1 NIPBL FN1 ASH1L PNKD BRPF1
在这些发现中，越来越多的意义未明变异(variants of uncertain significance, VUS)被认为是TS遗传学不断扩大的图景中的关键部分。尽管其分类存在不确定性，但许多VUS发生在具有合理解释的神经生物学作用的基因中，例如涉及离子通道活性、GABA能抑制、染色质重塑和神经元迁移的基因。重要的是，其中一些VUS可能在更广泛的寡基因或多基因背景下作为易感位点或修饰因子，与其他罕见或常见变异相互作用以影响表型表达和疾病严重程度。
基于此背景，本研究旨在阐明不同的遗传特征是否有助于将TS患者分层为有临床意义的亚型，并对早期诊断和个体化干预具有潜在意义。本研究特别调查了潜在致病性外显子变异，包括de novo
2 材料与方法
2.1 参与者
本研究在意大利卡塔尼亚大学医学和实验部的儿童和青少年神经病学与精神病学科进行。根据自我报告的种族评估血统，所有患者及其父母均报告为意大利血统。未进行遗传血统推断分析。总共80名根据DSM-5标准临床诊断为TS的患者（平均年龄12.84岁，男:女=70:10）在2023年4月至2025年4月期间被纳入研究。排除了主要精神疾病与TS不同和/或存在已知病因（如遗传或遗传代谢病）的患者。根据《赫尔辛基宣言》及其后续修正案制定的伦理标准，调查作为患者常规临床护理的一部分进行。在入组前，获得了所有参与者父母或法定监护人的书面知情同意。该研究获得了卡塔尼亚大学医院当地伦理委员会的批准。
2.2 程序
通过参与者的父母获取病史，重点关注发育迟缓、癫痫发作、神经精神疾病以及神经发育障碍和代谢性疾病的阳性家族史。所有参与者均接受了体格和神经系统检查。采集空腹血样和尿样进行常规血液分析并排除遗传代谢病。评估了癫痫发作和孤立性脑电图(electroencephalogram, EEG)异常的发生情况。此外，使用1.5 T MRI扫描仪检查脑部磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)，以检测形态学上可见的脑发育改变迹象和萎缩性改变。
2.3 临床评估
所有参与者都接受了针对TS及相关共病的全面神经精神评估。根据参与者的年龄，使用韦氏儿童智力量表(Wechsler Intelligence Scale for Children, WISC-IV)评估患者的智商(intelligence quotient, IQ)。使用耶鲁全球抽动严重程度评定量表(Yale Global Tic Severity Rating Scale, YGTSS)评估TS症状，这是一个临床评定量表，用于评估运动性和发声性抽动的严重程度，考虑了抽动的数量、频率、持续时间、强度和复杂性。
2.4 遗传分析
对从先证者及其父母的外周血样本中提取的DNA进行了基于临床外显子的分析。使用SureSelect All Exon v6试剂盒进行测序分析的文库构建，重点关注神经发育障碍（包括单核苷酸变异，single-nucleotide variants, SNVs和拷贝数变异，copy number variations, CNVs）。使用NGS技术进行测序。生物信息学分析包括使用BWA算法将序列比对到人类参考基因组GRCh37/hg19、去除非特异性比对、通过GATK、samtools和bcftools进行变异调用，以及目标基因覆盖度和读取深度的质量控制。
临床外显子分析涵盖了与神经发育障碍相关的1702个基因，对应于总共4,379,484个编码目标碱基。目标区域的平均覆盖深度(mean depth of coverage, DoC)为195.62x，而最大DoC为5,832.22x，平均99.29% ± 0.41的目标碱基在≥20×覆盖，99.72% ± 0.13在≥10×，99.87% ± 0.06在≥5×。
变异过滤使用以下标准：最小读取深度≥10×，基因型质量≥20，杂合变异的等位基因平衡≥0.25。排除在人群数据库中小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)>1%的变异。使用Sanger测序确认选定的变异。根据美国医学遗传学与基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)的指南进行变异解释，而最终的变异优先级排序和分类则使用下述整合方法进行。使用Polyphen-2、SIFT、CADD、MutationTaster、MutationAssessor和PhyloP等工具对每个变异进行计算机分析，以预测其对蛋白质结构和/或功能的影响及其进化保守性。
2.5 外显子数据分析和变异分类
使用整合了变异水平和基因水平证据的多步骤方法进行变异优先级排序和分类。在变异水平上，考虑了以下参数：变异类型、人群数据库中的次要等位基因频率(MAF)、计算机致病性预测分数以及预测的对蛋白质功能和进化保守性的影响。
随后，在基因水平上根据已知的基因-疾病关联评估变异，特别关注先前与抽动秽语综合征或其他神经发育和神经精神疾病有关的基因。通过将变异水平证据与基因水平信息相结合，最终分类为“潜在致病性”变异(potentially causative variants, PC-V)、“意义未明变异”(variants of uncertain significance, VUS)和“非致病性变异”(non-causative variants, NC-V)，并通过查阅科学文献和公共及私人基因组数据库进一步细化。
在本研究中，被归类为“潜在致病性”(PC-V)的变异是那些显示出低人群频率、高预测致病性影响以及合理的生物学相关性，并且发生在先前与TS或相关神经发育和神经精神疾病相关的基因中的变异，有OMIM和科学文献支持。当变异满足提示潜在功能相关性的变异水平标准，但缺乏足够或一致的证据与TS明确关联，仅在文献中零星报道或发生在与神经精神表型广泛相关的基因中时，则被归类为“意义未明变异”(VUS)。“非致病性”变异(NC-V)被定义为在文献或数据库中没有与TS关联证据的变异，和/或显示出有限的预测功能影响。使用基于家系的方法进行全外显子组测序，包括先证者和亲生父母，允许评估变异遗传并识别de novo
2.6 统计分析
对携带PC-V、VUS和NC-V的儿童进行统计学比较，以验证变异存在/缺失对畸形特征、共病、智力障碍(intellectual disability, ID)、YGTSS评分以及癫痫、EEG异常和脑部MRI异常发生率的影响。参与者的临床特征按随机分组使用连续数据的均值（标准差）或分类数据的计数和百分比进行总结。根据数据分布，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis检验进行连续变量的配对比较，使用卡方检验进行分类变量的比较。应用Kolmogorov-Smirnov检验评估数据分布并指导参数和非参数方法的选择。p值<0.05被认为具有统计学意义。
3 结果
3.1 遗传学发现
在80名TS儿童中，11名患者（8男3女）被分类为携带PC-Vs（13.75%），29名患者（25男4女）被分类为携带VUS（36.25%），40名患者（37男3女）被分类为携带NC-Vs（50%）。
十一例变异被归类为致病性/致病性变异，其中六例被鉴定为de novo
3.2 个体外显子组的遗传图谱统计
对于每个先证者，从最终的临床外显子报告中提取了经过质量控制和临床解释后保留的临床报告变异。在整个队列中，每个个体报告的变异数量从1到5个不等，包括单核苷酸变异(single-nucleotide variants, SNVs)和小片段插入/缺失(indels)。报告的变异大多数是编码变异，个体间罕见变异(MAF <1%)的比例各不相同。这些经过临床筛选的变异代表了用于基因型-表型相关性分析的子集，并根据变异类型、罕见程度和预测的功能影响进行分类。
3.3 队列的临床特征
本研究招募了80名临床诊断为TS的患者（平均年龄=12.84±4.65；男女比例=70/10），诊断依据耶鲁全球抽动严重程度评定量表(YGTSS)。
队列的整体临床和神经精神特征总结在表3中，而主要表型特征的频率分布则如图1所示。
平均总YGTSS评分为21.84±8.16，表明整体抽动严重程度为中度。认知功能具有异质性，平均IQ为85.29±24.04，反映了相当大比例的患者处于临界或受损的智力功能水平。
在观察到的临床特征中，畸形特征（52.5%）和存在至少一种精神共病（51.2%）是队列中最常检测到的特征。强迫症(obsessive–compulsive disorder, OCD)是最常见的精神共病（37.5%），其次是焦虑症（21.2%）和注意缺陷多动障碍(ADHD)（18.8%），证实了儿科TS中内化和神经发育症状的高负担。抽动阳性家族史（41.2%）的普遍性进一步强调了遗传因素在相当大比例病例中的相关性。
3.4 按变异分类分层后队列的临床特征
表4报告了χ²检验和ANOVA/Kruskal-Wallis分析的结果，比较了被分类为携带潜在致病性变异(PC-Vs)、意义未明变异(VUS)或非致病性变异(NC-Vs)患者的临床和神经精神特征。显著的配对差异如图2所示。
3.4.1 抽动严重程度
使用耶鲁全球抽动严重程度量表(YGTSS)评估的抽动症状严重程度呈现出渐进式梯度：携带潜在致病性变异(PC-Vs)的儿童表现出最高的平均评分（28±8.21），其次是意义未明变异(VUS)携带者（24.17±7.7），最后是非致病性组(NC-Vs)，其评分最低（18.45±6.98）。组间差异达到统计学显著性(p=0.001)，表明潜在致病性变异的存在与抽动表现方面更大的临床负担相关。
3.4.2 认知评估
PC-V组的平均智商显著降低（67.55±31.02），与VUS组（90.79±23.08）和NC-Vs组（86.36±20.25）相比。组间差异具有统计学显著性(p=0.020)，表明罕见的高影响变异不仅可能导致抽动严重程度增加，还可能导致更广泛的神经发育损伤。
3.4.3 EEG异常
少数患者记录到脑电图异常，频率从NC-Vs组的7.5%到VUS组的20.7%和PC-Vs组的9.1%不等。尽管存在这些差异，但总体比较未达到统计学显著性(p=0.245)，这表明在本队列中，EEG改变与变异类型没有系统性关联。
3.4.4 MRI分析
在MRI上识别的结构性脑异常相对常见，但在各组间分布相当。它们在27.3%的PC-V患者、34.5%的VUS患者和22.5%的NC-Vs患者中存在，没有显著的组间差异(p=0.546)。这些发现表明，虽然MRI改变在TS中并不少见，但它们似乎并不根据本研究中采用的遗传分类进行分离。
3.4.5 畸形特征
在所有亚组中均观察到显著的畸形特征频率，范围从NC-Vs组的45%到VUS携带者的62.1%。然而，这些差异未达到统计学显著性(p=0.371)。这表明，尽管畸形在儿科TS患者中很常见，但不能具体归因于某一个遗传亚组。
3.4.6 共病
精神共病在队列中非常普遍，但其分布在遗传亚组之间没有显著差异。强迫症(OCD)在NC-V组最常报告（42.5%），其次是VUS组（37.9%），在PC-Vs组中较少见（18.2%）。注意缺陷多动障碍(ADHD)则显示出相反的趋势，在PC-V携带者中最常见（27.3%），相比之下，VUS组为20.7%，NC-Vs组为15%。其他共病如对立违抗性障碍(oppositional defiant disorder, ODD)、焦虑和头痛总体发生率较低，没有显著的组间差异。精神共病的总体患病率在VUS（58.6%）和NC-Vs（52.5%）亚组中最高，而PC-V组为27.3%。
3.4.7 抽动家族史
在分析三个亚组中抽动家族史的分布时，出现了统计学上的显著差异(p=0.044)。在PC-V和VUS组中，家族聚集相对不常见，仅在27.3%和27.6%的患者中报告。相比之下，超过一半的NC-V亚组（55%）至少有一名有抽动障碍病史的家庭成员。
4 讨论
通过整合遗传学发现和详细的神经精神评估，本研究旨在为罕见外显子变异（包括de novo
我们的80名儿童和青少年TS队列以男性为主（男女比例7:1），平均年龄12.8岁，这与流行病学数据一致，显示抽动在男孩中患病率更高、发病更早。
从神经生物学和遗传学角度看，TS及相关神经发育障碍中的性别差异已在性别特异性易感性阈值和女性保护效应的框架内得到解释。根据这一模型，女性可能需要更高的累积遗传负担才能表现出明显的临床疾病，这一机制在多种神经发育状况中得到支持，并且越来越多地被TS相关表型的外显子组研究所提示。
在整个样本中，抽动范围从轻微到严重，精神共病如强迫症(OCD)、注意缺陷多动障碍(ADHD)、焦虑和对立违抗性障碍(ODD)很常见，反映了TS既定的临床谱系。畸形特征、智力障碍和癫痫也在相当大比例的患者中观察到，尤其是在携带潜在致病性变异(PC-Vs)的患者中。大约四分之一的队列存在MRI异常，约10-20%存在EEG异常，这些发现与文献中描述的可变但非特异性的神经系统改变一致。
遗传学亚分组揭示了清晰的临床区别。携带PC-Vs的儿童在耶鲁全球抽动严重程度量表(YGTSS)上表现出最高的抽动严重程度评分，并且与携带VUS或非致病性变异的儿童相比智商值显著更低。相反，没有候选变异的患者更常报告抽动阳性家族史，这支持了遗传性多基因负担驱动家族聚集，而de novo
基于这些观察，对个体PC-V病例的详细分析进一步揭示了特定基因如何影响抽动严重程度、认知结果和相关的共病。例如，携带KMT2C de novo PNKD
染色质调节因子的变异也成为相关的贡献者。例如，携带de novo BRPF1 SMARCA2
一些患者表现出涉及多基因或基因多效性效应的复杂表型。例如，患者6携带CACNA1D RERE MAPK8IP3 de novo
其他发现突显了解释上的挑战。例如，患者8携带SLC20A2 de novo PTEN de novo ANKRD17 de novo SLC6A1 SLC6A1
综上所述，这些病例突出了反复出现的主题：受限基因中的截短和de novo
我们的研究结果强调了罕见高效应变异和遗传性多基因负担在抽动秽语综合征发病机制中的互补作用。携带潜在致病性变异的患者往往表现出更高的抽动严重程度、更低的认知评分和综合征特征，而没有此类变异的家族性病例则反映了多基因遗传。对于具有非典型或综合征特征的患者，全面的基因组检测尤其必要，而未来整合罕见和常见变异分析、纵向表型分析和功能验证的研究，对于完善变异解释、改进分类框架和制定机制驱动的干预措施至关重要。
5 结论
本研究通过整合临床外显子测序和详细的表型评估，探索了儿科队列中抽动秽语综合征的遗传基础和临床异质性。研究结果证实了遗传机制的双重贡献：一方面，罕见的高影响变异与更严重的临床结局相关，包括更高的抽动严重程度、更低的认知评分和综合征特征；另一方面，缺乏明确致病性变异更强烈地与家族聚集相关，提示存在多基因或遗传背景。
从分子角度看，该研究强调了多种神经发育途径的参与，包括染色质重塑、突触传递和抑制性信号、离子通道功能以及多效性调节因子。这些结果强化了TS与其他神经发育障碍之间的重叠，并支持跨疾病存在共享遗传易感性的观点。
尽管有这些见解，但应承认一些局限性。相对较小的样本量限制了研究结果的统计功效和普遍性。此外，变异的分类，特别是意义未明变异(VUS)，仍然具有挑战性，并且可能随着新的功能和人群数据的出现而演变。并非所有病例都进行系统性的父母检测也限制了对某些家庭遗传模式的解释。
从临床角度看，该研究强调了外显子测序在复杂或非典型TS病例中的诊断效用。识别罕见的潜在致病性变异可能有助于指导患者管理、遗传咨询和风险分层，特别是在表现为智力障碍、畸形特征、癫痫或结构性脑异常的儿童中。同时，认识到家族性病例中的多基因遗传强调了在临床实践中同时考虑罕见和常见变异的重要性。
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