受调控的胞吐是细胞响应生理信号释放分泌物质的基本过程[1]。在人类精子中，这一机制驱动顶体胞吐（AE），这是受精所必需的钙依赖性事件[2]。在AE过程中，单个大型分泌颗粒——顶体与精子质膜融合，释放出穿透透明带所需的水解酶[3],[4],[5]。与突触小泡胞吐不同，AE是不可逆的，且不涉及膜回收，为研究专门的胞吐机制提供了独特模型[2]。
伴侣蛋白在胞吐过程中对蛋白质稳态至关重要。热休克相关蛋白70 kDa（Hsc70）及其共伴侣蛋白协调多蛋白复合物的折叠和组装[6],[7],[8]。半胱氨酸链蛋白（CSP）是一类保守的膜相关伴侣蛋白，主要在分泌细胞中发挥作用。在三种人类CSP异构体（CSPα、CSPβ和CSPγ）中，CSPα在神经分泌中的作用已被广泛研究[9],[10],[11]，并通过棕榈酰化与突触小泡结合[11],[12]。尽管CSPβ并非睾丸特异性的[11]，但在睾丸中的含量较高[13],[14],[15]。我们最近发现CSPβ在人类精子的AE过程中稳定了trans-SNARE复合物的组装[16]；此外，在小鼠中，CSPβ还能保护线粒体功能并调节精子发生过程中的自噬/胞质溶酶体作用，从而维持男性生育能力[15]。CSPγ定位于内分泌和分泌组织，但其功能尚不明确[11]。蛋白质组学分析进一步证实了这两种蛋白在纯化的人类精子中的存在[17]。人类CSPβ由199个氨基酸组成，包含四个保守结构域：N端的J结构域（促进与Hsc70的相互作用）、富含半胱氨酸的中央结构域（Cys结构域）、连接J结构域和Cys结构域的灵活连接区，以及无结构的C端区域。Cys结构域会发生棕榈酰化，从而促进膜定位[12],[18]。J结构域采用紧凑的三级结构，由四个α螺旋稳定，包含一个对Hsc70结合和ATP酶激活至关重要的保守HPD基序（His-Pro-Asp）[19]。人类Hsc70是一种646个残基的伴侣蛋白，具有核苷酸结合结构域（NBD）用于水解ATP、底物结合结构域（SBD）以及以保守的EEVD基序结尾的C端尾部，该基序介导伴侣蛋白之间的相互作用[20]。
在非神经元系统中，CSPα和Hsc70调节Xenopus卵母细胞中的皮质颗粒胞吐[21]。然而，它们在哺乳动物精子中的相互作用尚未被探索。虽然我们之前的研究表明CSP在人类精子的胞吐过程中促进了trans-SNARE复合物的组装[16]，但具体负责这一过程的异构体、其与Hsc70的物理相互作用以及这种相互作用对精子的功能影响仍不清楚。
酵母和细菌的研究表明，HPD基序（H43Q和D45A）的突变会损害CSP驱动的Hsc70 ATP酶活性，这突显了该基序在跨物种复合物形成中的关键作用[22]。Hsc70在人类精子中持续表达[23],[24],[25],[26]；然而，其与CSPβ的关联及其在AE中的机制作用尚未明确。
鉴于CSPα和CSPβ具有相似的结构域，可以合理假设CSPβ与Hsc70在伴侣关系中协同作用，这对AE至关重要。然而，直接的证据尚缺乏。现有模型强烈支持棕榈酰化在CSP家族成员的膜结合中的关键作用，以及J结构域在伴侣蛋白相互作用中的作用，但CSPβ的这些机制尚未得到直接证实。
在本研究中，我们发现CSPβ在人类精子的顶体区域与Hsc70形成功能性复合物，这种协作对AE是必需的，并且依赖于CSPβ的结构完整性。为了明确这种相互作用的分子界面，我们结合了生化实验、计算机模拟（in silico）和分子动力学模拟。我们还发现CSPβ具有持续的棕榈酰化状态，且这种修饰在精子获能过程中保持稳定。最后，外源性Hsc70可以恢复CSPβ介导的AE抑制作用，表明伴侣蛋白之间的动态平衡对受精至关重要。我们的发现揭示了一种新的伴侣蛋白驱动的机制，用于调控人类精子的胞吐过程，并提出CSPβ/Hsc70作为男性不育的潜在生物标志物和治疗靶点。
