研究背景与目的
失眠与睡眠不足是全球性的健康问题，可显著损害认知功能并增加神经退行性疾病风险。以苯二氮䓬类（BZs）为代表的药物虽能快速起效，但长期使用易产生耐受和依赖。天然植物提取物因其多靶点作用和安全性而备受关注。桑叶（MA）与蝶豆花（CT）的提取物在神经药理学方面已显示出潜在益处，但二者混合使用是否具有协同增效作用尚不明确。本研究旨在评估不同比例MA与CT混合物的体外活性，筛选最佳配比（MACT），并在大鼠体内系统评价其镇静催眠、改善认知及抗焦虑的作用，并探讨其是否通过GABAA受体依赖机制发挥作用。
材料与方法
植物材料制备：采用热水浸提法制备MA和CT提取物，并与麦芽糊精混合喷雾干燥成粉。对七种配比（0MA:1CT, 1MA:0CT, 1MA:1CT, 1MA:2CT, 1MA:3CT, 2MA:1CT, 3MA:1CT）进行体外评估，筛选出抗氧化能力及促进GABA活性最高的3:1混合比例（MACT），用于后续研究。
体外评估：测定总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总花青素含量（TAC），以及DPPH自由基清除、铁还原抗氧化能力（FRAP）和GABA转氨酶（GABA-T）抑制活性。使用高效液相色谱法（HPLC）对MACT、MA和CT的主要生物活性成分进行指纹图谱分析。
体内实验设计：采用成年雄性Wistar大鼠，植入脑电图（EEG）和肌电图（EMG）电极。实验分为两部分：实验1 评估MACT的剂量依赖性效应（125、250、500 mg/kg）并与单用MA或CT（均为500 mg/kg）比较；实验2 探究其作用机制，在使用GABAA受体竞争性拮抗剂bicuculline methiodide（Bi，2 mg/kg）后，观察MACT500 mg/kg的效应是否被逆转。
行为学与电生理学测试：实验流程如图1所示，包括：（1）新物体识别（NOR）测试前阶段，（2）连续3.5小时睡眠监测（前30分钟为基线期），（3）NOR测试后阶段，（4）高架十字迷宫（EPM）测试。睡眠分期标准基于EEG和EMG信号特征进行判别，具体标准如图2所示：高肌电功率判为清醒（Wake）；低肌电功率情况下，皮层脑电图功率在0.5–20 Hz且Delta波占优为非快速眼动（NREM）睡眠；Theta波占优则为快速眼动（REM）睡眠。
数据分析：使用自动化算法分析睡眠结构参数、NOR测试中的新物体偏好指数（NOPI）以及EPM测试中在开放臂的时间和进入次数。通过t-分布随机近邻嵌入（t-SNE）算法和最大均值差异（MMD）距离，对实验数据降维并定量分析各处理组脑功能调节模式的相似性与差异性。
结果
体外筛选与成分分析：初步体外实验表明，MA与CT以3:1比例混合（MACT）具有最强的抗氧化能力及GABA促进活性。HPLC分析显示，MACT中富含多种酚类和黄酮类化合物，如芦丁（0.266 mg/g提取物）、山奈酚（KAF， 0.037 mg/g提取物）；花青素类以矢车菊素-3-桑布双糖苷（C3S， 0.332 mg/g提取物）为主。MACT中KAF和C3S的含量均高于单独的MA或CT提取物。
实验1：MACT的剂量依赖性效应及与单味提取物比较
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睡眠微结构：MACT能剂量依赖性地缩短进入NREM和REM睡眠的潜伏期，减少清醒时间，增加REM睡眠时长和REM睡眠片段数（图3A-C）。高剂量MACT500的效果显著优于同等剂量（500 mg/kg）的MA或CT单独使用。
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认知功能（NOR测试）：MACT500能显著提高新物体偏好指数（NOPI），表明认知功能增强（图4A）。MA500和CT500虽也能提高NOPI，但效果弱于MACT500。各组动物运动总距离和平均速度无显著差异，表明认知改善与运动能力无关（图4B, C）。
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焦虑样行为（EPM测试）：MACT500能显著增加大鼠在开放臂停留时间的百分比和进入开放臂的次数（图5A, B），表现出抗焦虑效应。MA500和CT500也有类似效应，但CT500的效果显著弱于MACT500。
实验2：GABAA受体依赖性机制验证
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睡眠微结构：MACT500产生的缩短REM睡眠潜伏期、减少清醒时间、增加REM睡眠时长和片段数等有益效应，在预先给予Bi后均被显著逆转（图6A-C）。单独给予Bi本身对NREM和REM睡眠潜伏期及清醒、NREM时长无影响，但出乎意料地增加了REM睡眠时长和片段数，具体机制有待阐明。
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认知功能：MACT500提高的NOPI值可被Bi预处理完全逆转（图7A），表明其认知增强作用依赖于GABAA受体的激活。
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焦虑样行为：MACT500产生的抗焦虑效应（增加开放臂停留时间和进入次数）同样可被Bi预处理所拮抗（图8A, B）。
模式相似性分析：采用t-SNE算法将睡眠、认知和焦虑相关的高维数据降维至二维可视化（图9A）。定量分析（MMD距离）显示，MACT500处理组的特征模式与对照组差异最大，且显著远离MA500和CT500处理组。而Bi预处理（BiMACT500组）则使数据分布向对照组方向回归（图9B）。这表明MACT500对大脑功能的调节模式独特且高效，其效应主要通过GABAA受体依赖机制实现。
讨论
本研究证实，桑叶与蝶豆花以3:1比例混合（MACT）可协同增效，产生比单一成分更优的镇静催眠、认知增强和抗焦虑作用。其机制主要涉及对GABAA受体的调节。桑叶中的主要活性成分如芦丁、槲皮素（QUE）、山奈酚（KAF）等，以及蝶豆花中丰富的花青素（ATCs）如矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）、矢车菊素-3-桑布双糖苷（C3S）、锦葵色素-3-葡萄糖苷（M3G），均被报道具有GABA能调节和抗氧化活性。多植物配方（MACT）可能通过多种成分同时作用于多个靶点，从而获得更全面的神经调节效果。
HPLC分析提示，MACT中高含量的芦丁、C3S和KAF可能是其发挥优异神经活性的关键成分。特别是KAF，其脂溶性较高、分子构象灵活，可能更易穿透血脑屏障（BBB），快速发挥中枢作用。而花青素等亲水性成分可能通过载体介导转运或与KAF等成分结合，提高其生物利用度。
实验结果显示，MACT500能显著促进REM睡眠，而这一效应可被GABAA受体拮抗剂所逆转，提示MACT更倾向于作为GABAA受体激动剂来促进REM睡眠。与作用于苯二氮䓬位点的药物不同，直接激动GABAA受体活性位点可能在引发和维持REM睡眠中扮演更关键的角色，这或许是MACT发挥独特睡眠调节优势的机制之一。此外，MACT对认知和焦虑的改善同样依赖于GABAA受体的激活。
结论
综上所述，本研究首次报道了桑叶与蝶豆花以3:1比例混合（MACT）作为一种新型功能性成分，通过GABAA受体依赖机制，在大鼠模型中展现出剂量依赖性的改善REM睡眠、增强认知功能和抗焦虑行为的作用，且效果优于单一植物提取物。该研究为开发基于天然多植物配方的、针对GABAA受体相关神经精神疾病的替代药物或膳食补充剂提供了重要的临床前证据。
