皮肤是人类最大的器官，承担着保护、感觉和调节体温等重要功能。然而，当皮肤遭受大面积烧伤、严重创伤或患有慢性溃疡时，其结构和功能遭到破坏，往往需要移植皮肤来修复。在组织工程技术飞速发展的今天，科学家们已经能够在实验室中“制造”出包含表皮和真皮层的皮肤替代物。然而，一个核心的难题始终困扰着临床转化：如何让这些工程化皮肤快速建立有效的血液循环？没有及时充足的血液供应，移植的皮肤会因为缺氧和营养匮乏而坏死，导致移植失败。因此，为人工皮肤构建预血管网络，使其在植入后能迅速与宿主的血管系统连接（这一过程称为血管吻合），成为再生医学领域的关键课题。
为了攻克这一难题，研究人员需要寻找理想的血管“种子”细胞。传统上，用于构建血管网络的内皮细胞主要来源于人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)或人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。获取前者需要进行皮肤活检手术，来源有限且对供者有创伤；后者则需要脐带组织。有没有一种来源更丰富、获取更便捷、同时又与皮肤血管特性相近的内皮细胞来源呢？答案是肯定的——人体皮下脂肪组织。通过常见的脂质吸取术，我们可以轻松获得大量脂肪组织，并从中分离出包含多种细胞的基质血管成分(SVF)。SVF中富含内皮细胞，此前研究已证实这些细胞具有形成血管网络的潜力，并能与宿主血管连接。然而，一个尚未被详细探究的问题是：从皮下脂肪SVF中提取的内皮细胞，究竟是属于哪一类型的血管内皮细胞？它们是动脉、静脉还是淋巴管内皮细胞？它们在体外培养以及构建三维组织时，能否保持其特定的细胞身份并形成具有功能指向性的血管？这些问题的答案，对于精确调控工程化组织的血管生成和功能至关重要。
为此，研究人员在《组织工程与再生医学》期刊上发表了一项研究，系统地表征了人皮下脂肪SVF来源的内皮细胞，明确了其静脉和动脉内皮细胞的属性，并证实其在三维胶原水凝胶中能形成相应的毛细血管网络，同时确认了其中缺乏淋巴管内皮细胞(LECs)。
为了开展此项研究，研究人员采用了几个关键技术方法。首先是细胞分离技术，分别从人包皮组织通过CD31免疫磁珠分选获取人皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)作为对照，以及从人皮下脂肪脂质吸取样本中分离基质血管成分(SVF)。其次是细胞培养模型，包括常规的二维平面培养和三维胶原I型水凝胶培养系统，以模拟更接近体内的三维微环境。第三是关键的免疫荧光染色分析技术，通过对培养细胞、组织切片以及三维水凝胶进行全标本或切片染色，使用一系列特异性抗体标记物来鉴定内皮细胞亚型。主要使用的抗体标记包括：泛内皮细胞标记CD31，淋巴管内皮细胞标记PROX1和PDPN，血内皮细胞(BEC)标记PLVAP，静脉内皮细胞标记NR2F2（即COUP-TFII）和CD62E（选择素E），以及动脉内皮细胞标记NRP1。这些技术方法的组合应用，使得研究者能够精确追踪和分析SVF来源内皮细胞在两种培养环境下的表型和功能。
研究结果
3.1 人幼年包皮中BECs和LECs的标志物表达
作为对照，研究首先在人幼年包皮组织中验证了动脉、静脉和淋巴管内皮细胞标志物的表达。免疫荧光染色证实，真皮中存在表达泛内皮标志物CD31的血管。研究人员识别出了PDPN阳性/PROX1阳性的淋巴管内皮细胞(LECs)以及PDPN阴性/PROX1阴性/CD31阳性的血内皮细胞(BECs)。进一步分析显示，BECs可区分为NR2F2阳性/PDPN阴性的静脉内皮细胞和NR2F2阴性/PDPN阴性的动脉内皮细胞。此外，研究还观察到CD62E阳性/PLVAP阳性的静脉内皮细胞和CD62E阴性/PLVAP阳性的动脉内皮细胞。静脉内皮细胞特异性标记ACKR1的检测也证实了其表达。这些结果为人源内皮细胞亚型的鉴定提供了体内参照。
3.2 第一代人HDMECs中BECs和LECs的标志物表达
从包皮中分离的HDMECs（未经分选的BECs和LECs混合群体）在体外培养至第一代。免疫荧光分析显示所有细胞均表达CD31，表明获得了纯化的内皮细胞群体。与组织切片结果一致，培养的HDMECs中也存在表达PDPN/PROX1的LECs，以及PDPN阴性/PROX1阴性的BECs。BECs中可区分出NR2F2阳性/NRP1阴性的淋巴/静脉内皮细胞和NR2F2阴性/NRP1阳性的动脉内皮细胞。同时也检测到CD62E阳性/PLVAP阳性的静脉内皮细胞和CD62E阴性/PLVAP阳性的动脉内皮细胞，而LECs为PLVAP阴性/CD62E阴性。这表明分离培养的HDMECs保留了其异质性亚群。
3.3 第0代人SVF中BECs和LECs的标志物表达
从人皮下脂肪脂质吸取样本中分离出的未分选SVF，在培养至汇合时（第0代），可观察到呈圆形或球形并有聚集成簇倾向的内皮细胞。免疫荧光染色显示，SVF中存在表达CD31的内皮细胞小簇。进一步分析发现，这些CD31阳性细胞均不表达LECs标志物PROX1和PDPN，证实SVF中不存在LECs，所有内皮细胞均为BECs。通过静脉标志物NR2F2和动脉标志物NRP1进行区分，研究人员鉴定出NR2F2阳性/CD31阳性的静脉BECs。在本示例中未检测到NRP1表达的细胞，提示动脉BECs可能稀少或不存在。BECs泛标志物PLVAP的表达与CD31阳性细胞完全重叠，进一步支持了LECs的缺失。同时，CD62E表达的静脉BECs的存在，也再次证实了样本中动脉BECs的稀少。
3.4 SVF在3D胶原I型水凝胶中形成毛细血管
接下来，研究分析了培养的人SVF内皮细胞能否在胶原I型水凝胶中形成毛细血管网络并保留其特征性标志物。通过免疫荧光全标本染色观察到，由表达CD31的人内皮细胞形成的分支状毛细血管网络遍布于水凝胶中。高倍镜图像提供了更详细的视图。与二维培养结果一致，三维水凝胶中同样没有检测到PROX1阳性的内皮细胞，即不存在淋巴管。大多数毛细血管为NR2F2阳性，表明静脉毛细血管占主导地位，但也存在少数NR2F2阴性的动脉毛细血管。BECs标志物PLVAP在所有毛细血管上均有表达。CD62E染色也表明CD62E阳性/PLVAP阳性的静脉毛细血管占优势。然而，也观察到少数NRP1阳性/PLVAP阳性的毛细血管，证明了动脉毛细血管的存在。这些结果表明，SVF来源的内皮细胞在三维环境中能够自组装形成包含动、静脉亚型的毛细血管网络。
3.5 第0代人皮下脂肪来源SVF中缺乏PROX1
额外的分析进一步强调了LECs在分离的SVF中不存在。对SVF的二维细胞培养和三维预血管化皮肤替代物进行PROX1染色，并与HDMECs对比。在SVF的二维培养中，没有PROX1阳性细胞，而培养的HDMECs中则清晰可见PROX1阳性细胞。在三维培养的SVF中，同样未观察到PROX1阳性毛细血管，这与二维培养结果一致。相反，在培养的HDMECs（包括三维条件）中，可见PROX1阳性毛细血管。这一分析证实，从皮下脂肪样本中未分离出LECs。
结论与讨论
本研究系统地表征了来源于人皮下脂肪基质血管成分(SVF)的内皮细胞，确认其在二维和三维培养系统中均为血内皮细胞(BECs)，并可进一步区分为静脉和动脉亚型，同时明确缺乏淋巴管内皮细胞(LECs)。在三维胶原I型水凝胶中，这些细胞能够形成包含动、静脉的复杂微血管结构。
这项研究的意义是多方面的。首先，它明确了皮下脂肪SVF作为内皮细胞来源的细胞表型基础，即其主要提供静脉和动脉BECs，而缺乏LECs。这一发现对于设计具有完整血管功能的组织工程构建体至关重要，因为淋巴管的缺失可能影响组织液平衡和免疫应答。研究观察到静脉内皮细胞在培养中占主导，这可能反映了皮肤中静脉内皮细胞的自然丰度，也可能与体外缺乏血流剪切力导致Notch通路下调、从而更利于静脉表型维持有关。有趣的是，与二维培养相比，三维环境中出现了可检测的动脉标志物NRP1表达，提示三维培养环境更能模拟体内条件，有助于细胞表型的维持或恢复。
其次，该研究强化了皮下脂肪组织作为再生医学细胞来源的实用价值。通过常见的脂质吸取术即可大量获取，具有来源丰富、获取便捷、可实现自体移植避免免疫排斥等显著优势。SVF本身是一个包含内皮细胞、脂肪源性干细胞(ADSCs)、成纤维细胞等多种细胞的异质性群体，这种复杂性可能反而为血管网络的构建和稳定提供了有益的旁分泌支持和细胞间相互作用。
然而，研究也指出了未来的优化方向。例如，为构建功能更全面的血管化皮肤，可能需要通过磁珠分选等技术特异性富集动脉内皮细胞，或额外引入从皮肤等其他来源获取的LECs进行共培养。此外，供者个体差异（如年龄、健康状况等）对SVF内皮细胞活性和功能的影响，也是未来临床应用前需要评估的因素。
综上所述，这项工作不仅加深了我们对脂肪来源内皮细胞生物学的理解，而且为开发高效、功能化的预血管化皮肤替代物及其他组织工程产品提供了重要的实验依据和细胞来源策略，推动了再生医学向更精准、更实用的方向发展。
